癌の遺伝子治療用Epstein-Barrウイルスベクター開発の基礎的研究。

• Project/Area Number: 12877292
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Morphological basic dentistry
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 小林 家吉 九州大学, 大学院・歯学研究院, 講師 (40243951)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松尾 拡 九州大学, 大学院・歯学研究院, 助教授 (70238971) ; 坂井 英隆 九州大学, 大学院・歯学研究院, 教授 (80136499)
• Project Period (FY): 2000 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 2002: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2001: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2000: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 口腔癌 / 重層扁平上皮癌 / Epstein-Barrウイルス / polymerase chain reaction (PCR) / southern blotting / ウイルスベクター / 遺伝子治療 / アポトーシス / 胃癌 / polymerase chain reaction(PCR) / エレクトロポレーション / 扁平上皮癌 / Epstein-Barrウイルス(EBV) / polymerase chin reaction(PCR) / 相同組換え / エレクトポレーション / Green Fluorescent Protein(GFP)

Research Abstract

1.口腔癌培養細胞株における野生型Epstein-Barrウイルス(wEBV)の遺伝子発現パターンの検索:
昨年度の実績報告書に記述したように、EBV感染細胞をクローニングするには、antibiotic resistance geneを組み込んだEBVベクターをこの感染実験系に使用する事が最も効率よくクローニングできる方法である。しかしながら、組換えEBV(rEBV)(ジイオセーフティーレベル3)に対する封じ込め施設が稼動していないため、rEBVからwEBV(バイオセーフティーレベル2)へ実験対象を変更せざる負えなかった。そこで、口腔癌培養細胞(sMISK、MISK81-5、HSC-3)あるいは胃癌培養細胞(MKN74)とEBV産生Bリンパ培養細胞(AKATA細胞)との共培養法を用いて、wEBVを上皮細胞に感染させた後、EBV感染上皮細胞をクローニングする目的で限界希釈法を施行した。その結果、wEBV陽性クローニング細胞をsMISK 50クローン中15(30%)クローンに認めた。MISK81-5では24クローン(58.6%)に、MKN74は21クローン(87.5%)およびHSC3には17クローン(73.9%)であった。In vitroにおける従来の報告のEBV感染効率に比較して、我々の感染実験系では高頻度にwEBV陽性クローニング細胞を得る事ができた。また、現在の所、口腔癌細胞株におけるEBV陽性細胞のクローニングに成功した報告がなく、我々のこの報告が最初である。このクローニング細胞を使用して、口腔癌におけるEBVの潜伏感染様式を検索の後、ウイルス蛋白による口腔癌のアポトーシス変化機構を検索する。
2.EBV感染による口腔癌細胞のアポトーシス機構変化の検索:
今後、DNA microarray法を用いて、EBV感染による口腔癌細胞の遺伝子発現の変化を網羅的に検索し、感染後に高発現しているアポトーシス関連遺伝子を捉える。同様に、潜伏期に発現しているEBVDNAを強制発現系を用いてアポトーシス関連遺伝子の発現を検索し、アポトーシス誘導に対する責任EBV遺伝子を決定する。決定後、EBV産生蛋白とアポトーシス関連蛋白の相互作用をBinding assay系で明らかにしていく。

Research Products

• [Publications] Hiroko Wada et al.: "Expression of heat shock proteins, Hsj2,Hsc73 and Hsp86 during the morphogenesis of the mouse lower first molar"The Histochemical Journal. 34・3-4. 105-109 (2002)
• [Publications] Hideyuki Goto et al.: "Expression of cyclin D1 and GSK-3beta and their predictive value of prognosis in squamous cell carcinomas of the tongue"Oral Oncology. 31・6. 549-556 (2002)
• [Publications] Tamotsu Kiyoshima et al.: "An L1 element disrupts human bone sialoprotein promoter : lack of tissue-specific regulation by distalless5 (Dlx5) and runt homeodomain protein2 (Runx2)/core binding factor a1 (Cbfa1) elements"Gene. 299. 205-217 (2002)
• [Publications] Tamotsu Kiyoshima et al.: "Expression of p53 tumor suppressor gene in adenoid cystic and mucoepidermoid carcinomas of the salivary glands"Oral Oncology. 37・3. 111-118 (2001)
• [Publications] Kaori Shima et al.: "Incidence of human papillomavirus 16 and 18 infection and p53 mutation in patients with oral squamous cell carcinoma in Japan."Mol.Cell Biol. 38・5. 445-450 (2000)
• [Publications] Tamotsu Kiyoshima et al.: "Expression of p53 tumor suppressor gene in adenoid cystic and mucoepidermoid carcinomas of the salivary glands"Oral Oncology. 37・3. 111-118 (2001)