新規遺伝子導入技術の開発

Research Project

Project/Area Number	12878167
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Biomedical engineering/Biological material science
Research Institution	Japan Advanced Institute of Science and Technology
Principal Investigator	西坂剛北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 教授 (40101084)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	宮本裕一新エネルギー・産業技術総合開発機構, NEDOフェロー (00313718) 脇田政嘉北陸先端科学技術大学院大学, 材料科学研究科, 助手 (40324131)
Project Period (FY)	2000 – 2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000) Fiscal Year 2001: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000) Fiscal Year 2000: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Keywords	レーザ光誘起応力波 / 細胞内物質導入 / 遺伝子導入 / permeabilization / 着色微小球 / Flow cytometry / GFP / hydroxyapatite / 非ウィルス性ベクター / プラスミドDNA
Research Abstract	本研究において我々は,(1)着色微小球(直径1μm,青色)あるいは(2)hydroxyapatiteを細胞膜表面に付着させ,パルス波レーザ光誘起応力波(Laser induced stress wave : LISW)の効果を細胞膜上に限局するモデルを提案し,細胞のtransient permeabilityおよび遺伝子導入効率を評価することで,本モデルの有効性を検証した.実験はマウスリンパ腫由来の細胞を対象として行われ,Nd : YAGレーザ(Spectra Physics GCR-150,パルス半値全幅7-9ns,繰返し周波数10Hz)の第二高調波532nmを用いた.Permeabilizationの評価は,照射後の細胞をPropidium IodideおよびFluorescein diacetateにて染色し,Flow cytometerにより生・死細胞および膜透過性を示す細胞を検出した.導入plasmid DNAにはpEGFP-Fを用い,同様にFlow cytometerにより遺伝子発現細胞を定量した.レーザ光照射直後において,膜透過性を示す細胞の割合は照射パワー密度,照射時間および微小球添加量に依存して変化し,膜透過性はレーザ光照射後50分間持続した.61%の細胞が膜透過性を示したとき,死細胞は13%であった.一方,plasmid DNAの導入試験では,レーザ光照射群においてGFPの発現が認められ,その蛍光強度は非レーザ照射群の20倍に達した.細胞表面または近傍の微小球あるいはhydroxyapatiteから発生するLISWが細胞膜の透過性を高めたものと考える.本手法はレーザ光のパワー密度により細胞のPermeabilizationの程度を制御することが可能であり,遺伝子を含むmacromoleculeの細胞内導入に利用できるものと考えられる.