高速ＡＦＭによる膜輸送タンパク質一分子の動的構造解析

• Project/Area Number: 12J00228
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: Osaka University (2014); Keio University (2012-2013)
• Principal Investigator: 山下 隼人 大阪大学, 基礎工学研究科, 助教
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥3,960,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2012: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: 高速原子間力顕微鏡 / 1分子イメージング / ナノ計測 / アクアポリン / ABCトランスポーター / チャネル

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を用いて疾患に関与する膜輸送タンパク質1分子を直接可視化する事により、構造ダイナミクスや分子間相互作用を捉え、疾患発症の分子メカニズム解明に繋げる事が目的である。本年度の研究実績を以下に記述する。
1. ABCトランスポーター1分子の構造解析
昨年度までに構築した測定条件をもとに、ABCトランスポーターの中で唯一のイオンチャネルであり、嚢胞性線維症(CF)の原因タンパク質であるCFTRの1分子観察とその構造解析を行った。CFTRはパッチクランプ法を用いた電流計測により細胞膜中で単量体として機能する事が示唆されてきたが、構造状態に関しては依然として議論が続いていた。高速AFMによる解析の結果、可溶化状態ではほとんどが2量体で、再構成膜中ではほとんどが単量体である事が強く示唆された。これはCFTRの機能ユニットに関する議論に構造的証拠を与えるものと考えられる。
2. アクアポリン4(AQP4)の分子集合と「自己免疫疾患」初期分子過程の解明
AQP4は脳のアストロサイトで多量に発現し、自己免疫疾患である視神経脊髄炎(NMO)に関与している。そこで、NMO初期過程の分子レベルでの可視化に取り組んだ。昨年度AQP4M23のアレイ集合の可視化に成功したが、本年度はM1を観察した結果、ほとんどのAQP4-4量体が離散分布で、一部がクラスター集合している様子の撮影に成功した。そこで、それぞれにAQP4モノクロナル抗体やNMO-IgGを投与して高速AFM観察を行った結果、アレイのM23やクラスターのM1上では抗体がBivalentに結合し、抗体1分子中の2つのFabを使って、集合AQP4上を（歩くように）ダイナミックに移動している様子が観察された。これらの結果から、AQP4の集合状態が疾患発症の初期過程である抗体結合の親和性に強く関係している事が示唆された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] ATP hydrolysis–driven gating of an ABC transporter CFTR channel: from stills to movies (2013)
  • Author(s): 相馬義郎・山下隼人
  • Journal Title: Folia Pharmacologica Japonica Volume: 141 Issue: 5 Pages: 230-234
  • DOI: 10.1254/fpj.141.230
  • NAID: 10031171122
  • ISSN: 0015-5691, 1347-8397
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Role of trimer-trimer interaction of bacteriorhodopsin studied by optical spectroscopy and high-speed atomic force microscopy (2013)
  • Author(s): Hayato Yamashita
  • Journal Title: Journal of structural biology Volume: (印刷中)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single molecule imaging on living bacterial cell surface by high-speed AFM (2012)
  • Author(s): Hayato Yamashita
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology Volume: 422 Issue: 2 Pages: 300-309
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2012.05.018
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Structure and fluctuation of single CFTR molecules observed by high speed atomic force microscopy (2014)
  • Author(s): 相馬義郎、山下隼人
  • Organizer: 国際シンポジウム "Cystic fibrosis in Asia from basic to clinics"
  • Place of Presentation: 名古屋大学
  • Year and Date: 2014-09-29 – 2014-09-30
• [Presentation] High speed AFM observation for degradation process of collagen fibril by collagenase (2014)
  • Author(s): 山下隼人、寺村直子、田中啓友、服部俊治、飯嶋克昌、林田治、興津輝、相馬義郎
  • Organizer: 第52回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡 (High-speed AFM) を用いた微生物細胞表層の可視化 (2014)
  • Author(s): 田岡東、山下隼人、Oestreicher Zachery、福森義宏
  • Organizer: 日本農芸化学会2014年度大会
  • Place of Presentation: 明治大学
  • Year and Date: 2014-03-30
• [Presentation] CARS顕微鏡と高速原子間力顕微鏡 : 上皮膜輸送研究に有用な2つの革新的測定技術 (2014)
  • Author(s): 相馬義郎、山下隼人、余盈君、安井正人
  • Organizer: 第91回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 鹿児島大学
  • Year and Date: 2014-03-16
• [Presentation] Direct observation of aquaporin-4 channels by high speed AFM (2013)
  • Author(s): 山下隼人、会津心之亮、加藤純悟、阿部陽一郎、安井正人、相馬義郎
  • Organizer: 日本生物物理学会第51回年会
  • Place of Presentation: 国立京都国際会館
  • Year and Date: 2013-10-29
  • Invited
• [Presentation] 電子顕微鏡と高速AFMにより明らかになった核ラミンの動的構造変化 (2012)
  • Author(s): 三尾 和弘
  • Organizer: 日本分子生物学会第35回年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場(福岡県)
  • Year and Date: 2012-12-13
• [Presentation] Single molecular observation of CFTR channels by high speed AFM (2012)
  • Author(s): 山下 隼人
  • Organizer: 日本生物物理学会第50回年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2012-09-23
• [Presentation] 高速AFMで捉えた膜タンパク質のナノダイナミクス (2012)
  • Author(s): 山下 隼人
  • Organizer: 日本生物物理学会若手の会関東支部セミナー
  • Place of Presentation: 東京大学(東京都)(招待講演)
  • Year and Date: 2012-08-04