新規シグナル分子ニトロcGMPによるオートファジー誘導機構の解明と創薬への応用

• Project/Area Number: 12J06857
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: ケミカルバイオロジー
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 伊藤 千秋 東北大学, 大学院生命科学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2012 – 2013
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2013: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2012: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 8-ニトロcGMP / オートファジー / S-グアニル化 / ユビキチン / cGMP

Research Abstract

8-ニトロcGMPによるオートファジー誘導メカニズムの解明を行うために行った実験と成果を述べる。[菌表面のS-グアニル化修飾とユビキチン集積の関係(成果1)]
ユビキチン活性化酵素の阻害剤であるPYR-41を用いて、細胞内に感染させたA群連鎖球菌の表面へのユビキチン集積を抑制することに成功した。この時、菌表面への8-ニトロcGMPによる修飾(S-グアニル化修飾)には影響を与えないことが免疫細胞化学染色によって明らかになった。なお、8-ニトロcGMPによるS-グアニル化修飾反応を阻害するとユビキチン集積は有意に抑制されたことから、S-グアニル化修飾がユビキチン集積の引き金となることが示された。
[菌表面でS-グアニル化修飾されているタンパク質の同定(成果2)]
A群連鎖球菌を感染させたRAW 264.7細胞のライセートをウエスタンブロット解析し、S-グアニル化陽性タンパク質から細菌由来のタンパク質であるグリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)と、フルクトースビスフォスフェイトアルドラーゼの二つを同定した。本成果は成果1と合わせて、「細菌排除タグであるユビキチンがどのように細菌を認識して付加するのか」という、これまで明らかになっていなかった仕組みの解明につながる重要な成果である。
[8-ニトロcGMP誘導体のオートファジー誘導能評価(成果3)]
8-ニトロcGMP誘導体のオートファジー誘導能を評価するため、ハンチントン病モデル細胞を用いた実験系を立ち上げた。長さの異なるpolyQを組み込んだハンチントンタンパク質を発現するNeuro2aを入手し、ウエスタンブロット法やドットブロット法で解析を行うためのサンプル調整法を確立した。予備試験では、8-ニトロcGMPがハンチントンタンパク質量を抑制させるという結果が得られている。さらに細菌感染系では、ある8-ニトロcGMP誘導体は細菌排除に有効ではない結果が得られた。本成果は、今後オートファジー誘導効果のある8-ニトロcGMP誘導体を設計する際に重大な知見となる。

Strategy for Future Research Activity

(抄録なし)

Research Products

• [Journal Article] Endogenous nitrated nucleotide is a key mediator of autophagy and innate defense against bacteria. (2013)
  • Author(s): Ito C, Saito Y, Nozawa T, Fujii S, Sawa T, Inoue H, Matsunaga T, Khan S, Akashi S, Hashimoto R, Aikawa C, Takahashi E, Sagara H, Komatsu M, Tanaka K, Akaike T, Nakagawa I, Arimoto H.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 52 Issue: 6 Pages: 794-804
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2013.10.024
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fluorescent probes for live cell imaging of endogenous guanine nitration (2013)
  • Author(s): Saito Y, Ito C, Fujii S, Sawa T, Akaike T and Arimoto H.
  • Journal Title: Chembiochem. Volume: 14 Issue: 9 Pages: 1068-1071
  • DOI: 10.1002/cbic.201300129
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nitric oxide promotes recycling of 8-nitro-cGMP, a cytoprotectivemediator, into intact cGMP in cells (2012)
  • Author(s): Yohei Saito, Tomohiro Sawa, Jun Yoshitake, Chiaki Ito, Shigemoto Fujii, Takaaki Akaike and Hirokazu Arimoto
  • Journal Title: Moi BioSyst Volume: 8 Issue: 11 Pages: 2909-2915
  • DOI: 10.1039/c2mb25189b
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 8-ニトロcGMPは、内因性のオートファジー制御因子である (2013)
  • Author(s): 伊藤 千秋
  • Organizer: 第7回オートファジー研究会
  • Place of Presentation: ヤマハリゾートつま恋(静岡県掛川市)
• [Presentation] Effects of nitrated cGMP on the host defense against intracellular bacteria (2012)
  • Author(s): OChiaki Ito, Yohei Saito, Takashi Nozawa, Shigemoto Fujii, Tomohiro Sawa, Takaaki Akaike, Ichiro Nakagawa and Hirokazu Arimoto.
  • Organizer: EMBO Conference Series Chemical Biology 2012
  • Place of Presentation: EMBL Heidelberg, Germany
  • Year and Date: 2012-09-27
• [Presentation] ニトロcGMPの細胞内細菌排除に与える効果 (2012)
  • Author(s): 伊藤千秋、斎藤洋平、野澤孝志、澤智裕、赤池孝章、中川一路、有本博一
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第七回年会
  • Place of Presentation: 京都大学 百周年記念ホール
  • Year and Date: 2012-06-08