TALEヌクレアーゼを用いた遺伝子ノックイン/ノックアウト技術の確立と応用

• Project/Area Number: 12J06938
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: 応用ゲノム科学
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 佐久間 哲史 広島大学, 大学院・理学研究科, 特別研究員(PD) (90711143)
• Project Period (FY): 2012 – 2013
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2012)
• Budget Amount: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2012: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: TALEN / Golden Gate法 / 人工ヌクレアーゼ / ゲノム編集

Research Abstract

本年度は、TALENの効率的な作製法と評価法を確立し、哺乳動物培養細胞および動物個体への応用が可能であることを確かめるため、以下の通り研究を実施した。TALENは標的のDNA配列を認識するリピートを任意の並びで組み合わせることで、配列特異的にゲノムDNAを切断できる人工ヌクレアーゼである。切断されたゲノムDNAはただちに修復されるが、この際の偶発的なエラーによって目的の遺伝子を破壊することが可能となる。Addgeneから配布されているTALEN作製キットであるGolden Gate TALEN and TAL Effector Kitは、汎用性が高く世界中で広く利用されているが、リピートの連結効率に難があり、また構築したTALENの活性評価に多くの時間を要するという難点があった。本研究では、キットのベクターに改変を加えることで、一度に連結するリピートの数を減らし、アセンブリーの成功率を飛躍的に上昇させることに成功した。また、TALENの活性評価法として、ヒト培養細胞であるHEK293T細胞を用いたアッセイ系を採用することで、オリジナルの酵母でのアッセイ系と比べて大幅な時間短縮と作業効率の向上を実現した。本研究によって確立されたTALENの作製システムは、既に国内外で広く使用されており、ヒトiPS細胞を含む哺乳動物培養細胞に加え、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル、ラットなど様々な動物に適用可能であることが示されている。本研究で開発した改変ベクターは、近くオリジナルのキットのアドオンとして配布が開始される見込みであり、今後世界中で更なる利用が期待される。

Research Products

• [Journal Article] Efficient gene targeting by TAL effector nucleases coinjected with exonucleases in zygotes (2013)
  • Author(s): Tomoji Mashimo
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 3 Issue: 1 Pages: 1253-1253
  • DOI: 10.1038/srep01253
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High efficiency TALENs enable F0 functional analysis by targeted gene disruption in Xenopus laevia embryos (2013)
  • Author(s): Ken-ichi T Suzuki
  • Journal Title: Biology Open Volume: (in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative assay for TALEN activity at endogenous genomic loci. (2013)
  • Author(s): Hisano Y.
  • Journal Title: Biology Open Volume: BIO20133871 Issue: 4 Pages: 363-367
  • DOI: 10.1242/bio.20133871
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient TALEN construction and evaluation methods for human cell and animal applications. (2013)
  • Author(s): Sakuma T, Hosoi S, Woltjen K, Suzuki KI, Kashiwagi K, Wada H, Ochiai H, Miyamoto T, Kawai N, Sasakura Y, Matsuura S, Okada Y, Kawahara A, Hayashi S, Yamamoto T.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: (In press) Issue: 4 Pages: 315-326
  • DOI: 10.1111/gtc.12037
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The 3'UTR of Nanos2 directs enrichment in the germ cell lineage of the sea urchin (2013)
  • Author(s): Nathalie Oulhen
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: (in press) Issue: 1 Pages: 275-283
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2013.01.019
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient targeted mutagenesis in medaka using custom-designed transcription activator-like effector nucleases (TALENs) (2013)
  • Author(s): Satoshi Ansai
  • Journal Title: Genetics Volume: 193 Issue: 3 Pages: 739-749
  • DOI: 10.1534/genetics.112.147645
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Enhancer activity sensitive to the orientation of the gene it regulates in the chordate genome (2013)
  • Author(s): Akiko Hozumi
  • Journal Title: Developmental Biology Volume: 375 Issue: 1 Pages: 79-91
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2012.12.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] TALE nuclease (TALEN)を用いた培養細胞におけるゲノム編集 (2013)
  • Author(s): 落合博
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 31 Pages: 95-100
• [Journal Article] Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. (2012)
  • Author(s): Watanabe T, Ochiai H, Sakuma T, Horch HW, Hamaguchi N, Nakamura T, Bando T, Ohuchi H, Yamamoto T, Noji S, Mito T.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 3 Issue: 1 Pages: 1017-1017
  • DOI: 10.1038/ncomms2020
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Zinc-finger nuclease-mediated targeted insertion of reporter genes for quantitative imaging of gene expression in sea urchin embryos. (2012)
  • Author(s): Ochiai H, Sakamoto N, Fujita K, Nishikawa M, Suzuki K, Matsuura S, Miyamoto T, Sakuma T, Shibata T, Yamamoto T.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Volume: 109 Issue: 27 Pages: 10915-10920
  • DOI: 10.1073/pnas.1202768109
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Efficient targeted mutagenesis of the chordate Ciona intestinalis genome with zinc-finger nucleases. (2012)
  • Author(s): Kawai N, Ochiai H, Sakuma T, Yamada L, Sawada H, Yamamoto T, Sasakura Y.
  • Journal Title: Development, Growth & Differentiation Volume: 54 Issue: 5 Pages: 535-545
  • DOI: 10.1111/j.1440-169x.2012.01355.x
  • NAID: 10031136923
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 人工ヌクレアーゼを用いたゲノム編集 (2012)
  • Author(s): 佐久間哲史
  • Journal Title: Medical Science Digest Volume: 38 Pages: 328-329
• [Presentation] 人工ヌクレアーゼを利用したゲノム編集研究の現状 (2012)
  • Author(s): 佐久間哲史
  • Organizer: 第2回ゲノム編集研究会
  • Place of Presentation: 愛知県岡崎市
  • Year and Date: 2012-09-20
• [Presentation] Improved TALEN construction and evaluation methods for animal and human cell applications (2012)
  • Author(s): Tetsushi Sakuma
  • Organizer: FASEB Science Research Conference Genome Engineering - Research & Applications
  • Place of Presentation: Lucca, Italy
  • Year and Date: 2012-09-03
• [Presentation] Advanced methods for the construction, evaluation and application of TALENs (2012)
  • Author(s): Tetsushi Sakuma
  • Organizer: Joint Meeting of The 45th Annual Meeting of the Japanese Society of Developmental Biologists & The 64th Annual Meeting of the Japan Society for Cell Biology
  • Place of Presentation: 兵庫県神戸市
  • Year and Date: 2012-05-28