マツノザイセンチュウの病原因子の解明とその進化的起源の検証

• Project/Area Number: 12J09215
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied entomology
• Research Institution: Chubu University
• Principal Investigator: 新屋 良治 中部大学, 応用生物学部, 特別研究員(SPD)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥8,520,000 (Direct Cost: ¥7,800,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2014: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2013: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2012: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
• Keywords: マツノザイセンチュウ / オキナワザイセンチュウ / トランスジェニック / ノックアウト / CRISPR/Cas9 / ゲノム / 遺伝学 / 遣伝子破壊

Outline of Annual Research Achievements

昨年度取得したゲノム情報をもとに、マツノザイセンチュウとその近縁種であるオキナワザイセンチュウ（Bursaphelenchus okinawaensis) を使ってトランスジェニック線虫の作製手法の開発に取り組んだ。オキナワザイセンチュウは雌雄同体（マツノザイセンチュウは雌雄異体）の種であることからトランスジェニックや遺伝子破壊株作製手法の開発を行なう上で有用な線虫種である。まず、複数のオキナワザイセンチュウプロモーター配列および3’UTR配列をGFPとともにプラスミドに組み込みトランスジェニック線虫作製用コンストラクトを作製した。マイクロインジェクション法を用いてトランスジェニック線虫の作製を試みたがマツノザイセンチュウやその近縁種では本手法により良い結果が得られなかった。次に、パーティクルガンを用いた手法を試した。本手法ではオキナワザイセンチュウにおいて比較的効率良くGFPを発現するトランスジェニック線虫を分離できるようになった。現在では世代を超えて効率良く導入遺伝子が受け継がれるように手法の最適化を行っている。さらに今年度はトランスジェニック線虫作製手法の開発と併せてCRISPR/Cas9法を用いた標的遺伝子破壊法の開発にも取り組んできた。まず取得したゲノム情報を下にC. elegansのdpy変異体の原因遺伝子のホモログ分子をオキナワザイセンチュウにおいて探索し、２つのdpy様遺伝子を標的とするsgRNAを作出した。このコンストラクトをCas9タンパク質をコードするmRNAさらには精製タンパク質と同時に線虫体内に導入することにより標的遺伝子破壊株の作出を試みている。現在までに目的変異体の取得には成功していないが、上記のトランスジェニック線虫作出手法の最適化と併せて条件の最適化を継続することにより近い将来に変異体の分離が行えると考えている。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Catalases induction in high virulence pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus under hydrogen peroxide-induced stress (2015)
  • Author(s): Vicente CSL, Ikuyo Y, Shinya R, Mota M, Hasegawa K
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: なし Issue: 4 Pages: e0123839-e0123839
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0123839
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Sex attraction and mating in Bursaphelenehcus okinawaensis and B. xylophilus. (2015)
  • Author(s): Shinya R, Chen A, Sternberg PW
  • Journal Title: Journal of Nematology Volume: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Evidence of Hermaphroditism and Sex Ratio Distortion in the Fungal Feeding Nematode Bursaphelenchus okinawaensis (2014)
  • Author(s): Shinya R, Hasegawa K, Chen A, Kanzaki N, Sternberg PW
  • Journal Title: G3-Genes Genomes Genetics Volume: 4 Issue: 10 Pages: 1907-1917
  • DOI: 10.1534/g3.114.012385
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Secretome Analysis of the Pine Wood Nematode Bursaphelenchus xylophilus Reveals the Tangled Roots of Parasitism and Its Potential for Molecular Mimicry (2013)
  • Author(s): Shinya R, Morisaka H, Kikuchi T, Takeuchi Y, Ueda M, Futai K
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: なし Issue: 6 Pages: e67377-e67377
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0067377
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Making headway in understanding pine wilt disease : What do we perceive in the postgenomic era? (2013)
  • Author(s): Ryoji Shinya, Hironobu Morisaka, Yuko Takeuchi, Kazuyoshi Futai, Mitsuyoshi Ueda
  • Journal Title: Journal of Bioscience and Bioengineering Volume: 116 Issue: 1 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.jbiosc.2013.01.003
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Establishment of a set of inbred strains of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Aphelenchida : Aphelenchoididae), and evidence of their varying levels of virulence. (2012)
  • Author(s): Rvoji Shinya, Yuko Takeuchi, Keita Ichimura, Shuhei Takemoto, Kazuyoshi Futai
  • Journal Title: Applied Entomology and Zoology Volume: 47 Issue: 4 Pages: 341-350
  • DOI: 10.1007/s13355-012-0124-8
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Incorporation of the C. elegans toolkit into the nematology (2014)
  • Author(s): Shinya R
  • Organizer: Japan-Korea Joint symposium on Nematology
  • Place of Presentation: 文部科学省研究交流センター ( 茨城県・つくば市 )
  • Year and Date: 2014-09-18 – 2014-09-20
  • Invited
• [Presentation] The genetics of the hermaphroditic nematode Bursaphelenchus okinawaensis (2014)
  • Author(s): Shinya R, Hasegawa K, Chen A, Kanzaki N, Sternberg PW
  • Organizer: 日本線虫学会第22回大会
  • Place of Presentation: 文部科学省研究交流センター ( 茨城県・つくば市 )
  • Year and Date: 2014-09-16 – 2014-09-18
• [Presentation] Lack of the function for oxidative stress response in the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus low virulent strain (2014)
  • Author(s): Vicente CSL, Soga K, Shinya R, Mota M., Hasegawa K
  • Organizer: 日本線虫学会第22回大会
  • Place of Presentation: 文部科学省研究交流センター ( 茨城県・つくば市 )
  • Year and Date: 2014-09-16 – 2014-09-18
• [Presentation] Evolution of sex and reproductive strategies: hermaphroditism and sex determination in the fungal feeding nematode Bursaphelenchus okinawaensis (2014)
  • Author(s): Shinya R, Hasegawa K, Chen A, Kanzaki N, Sternberg PW
  • Organizer: Asia-Pacific C. elegans meeting
  • Place of Presentation: 奈良県新公会堂 ( 奈良県・奈良市 )
  • Year and Date: 2014-07-15 – 2014-07-19
• [Presentation] The evolution of sex: sex-ratio distortion and sex determination in the hermaphroditic fungal feeding nematode Bursaphelenchus okinawaensis (2014)
  • Author(s): Shinya R, Hasegawa K, Chen A, Kanzaki N, Sternberg PW.
  • Organizer: Evolutionary Biology of Caenorhabditis and other Nematodes
  • Place of Presentation: Hinxton, UK
  • Year and Date: 2014-06-14 – 2014-06-17
• [Presentation] Virulence and oxidative stress response of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus (2014)
  • Author(s): Vicente CSL, Ikuyo Y, Shinya R, Mota M., Hasegawa K
  • Organizer: 6th International Congress of Nematology
  • Place of Presentation: Cape town, South Africa
  • Year and Date: 2014-05-04 – 2014-05-09
• [Presentation] Pheynotypic and genotypic traits of recombinant inbred lines of pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (2013)
  • Author(s): Kato T, Kaneko A, Shinya R, Futai K and Takeuchi Y
  • Organizer: Pine wilt disease conference 2013
  • Place of Presentation: Braunschweig, Germany
  • Year and Date: 2013-10-15 – 2013-10-18
• [Presentation] Correlation between virulence and oxidative stress response of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus and B. mucronatus (2013)
  • Author(s): Vicente C, Ikuyo Y, Shinya R, Mota M, Hasegawa K
  • Organizer: 日本線虫学会第21回大会
  • Place of Presentation: 唐津市民交流プラザ ( 佐賀県・唐津市 ）
  • Year and Date: 2013-09-05 – 2013-09-06
• [Presentation] Construction of recombinant inbred lines of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, and evaluation of their key phenotyries (2012)
  • Author(s): Akira Kaneko, Ryoji Minya, Kazuyoshi Futai, Yuko Takeuchi
  • Organizer: 31st International Symposium of the European Society of Nematologists
  • Place of Presentation: Adana in Turkey
  • Year and Date: 2012-09-25
• [Presentation] マツノザイセンチュウ純系における病原力と媒介昆虫への便乗力との関係 (2012)
  • Author(s): 金子彰・新屋良治・竹本周平・二井一禎・竹内祐子
  • Organizer: 日本線虫学会第20回大会
  • Place of Presentation: つくば(文部科学省研究交流センター 国際会議場)
  • Year and Date: 2012-09-18
• [Presentation] プロテオームデータ処理のこれまでとこれから (2012)
  • Author(s): 新屋良治
  • Organizer: バイオアナリシスシンポジウム
  • Place of Presentation: 神戸(神戸大学)
  • Year and Date: 2012-05-01
  • Invited
• [Book] 線虫学実験（ 第６章 線虫のタンパク・遺伝子（ 核酸 ）実験法 ） (2014)
  • Author(s): 新屋良治
  • Total Pages: 10
  • Publisher: 京都大学出版
• [Book] 線虫学実験（ Appendix 線虫タンパク質と寄生性の関係 ） (2014)
  • Author(s): 新屋良治
  • Total Pages: 3
  • Publisher: 京都大学出版
• [Book] 微生物生態学への招待 ―森をめぐるミクロな世界(第14章担当) (2012)
  • Author(s): 新屋良治
  • Total Pages: 372
  • Publisher: 京都大学学術出版会