卵子が精子をエンドサイトーシスにより取りこむ過程の解析

• Project/Area Number: 12J09656
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Obstetrics and gynecology
• Research Institution: Chiba University
• Principal Investigator: 大和屋 健二 千葉大学, 医学研究院, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥3,630,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2014: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2013: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2012: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: 受精 / 先体反応 / 脱凝縮 / 先体 / 精子 / エンドサイトーシス / 糖タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

配偶子膜融合から精子頭部が脱凝縮する過程でエクアトリンタンパク質と相互作用するタンパク質を同定すために精子タンパク質を可溶化する条件の最適化を行った。受精を阻害しない抗エクアトリン抗体EQ70-83を用いて免疫共沈降し質量解析を行なった結果、先体膜タンパク質や膜裏打ちタンパク質、プロテアソーム関連タンパク質を同定することができた。現在、エクアトリンノックアウトマウスや緑色蛍光タンパク質EGFPタグをつけたエクアトリンタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いて解析を進めている。
受精過程の解析のなかでエクアトリンタンパク質は先体反応過程で翻訳後修飾を受けることを発見した。エクアトリンタンパク質を基質としてエクアトリンタンパク質の分子量変化を指標にその酵素の精製条件を検討した結果、その酵素の活性を保ったまま可溶化してくることができた。現在、同定に向けた精製を行ってる。
精子・卵子膜融合後のライブイメージング解析の結果、緑色蛍光タンパク質EGFPタグをつけたエクアトリンタンパク質の挙動を抗体によらない方法で追うことができた。解析をin vitroで行うために卵を用いない方法で精子頭部の脱凝縮を起こさせ比較を行っている。
受精過程のライブイメージングを最適化する目的で行っていた精子先体反応の解析の結果、各種精子先体タンパク質の挙動と翻訳後修飾変化を詳細にに追うことができるようになった。（現在論文投稿中）

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Analysis of the complexity of the sperm acrosomal membrane by super-resolution stimulated emission depletion microscopy compared with transmission electron microscopy (2014)
  • Author(s): Ito C., Yamatoya K., Toshimori K.
  • Journal Title: Microscopy Volume: e-pub ahead of print Issue: 4 Pages: 249-287
  • DOI: 10.1093/jmicro/dfu101
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Integration of the mouse sperm fertilization-related protein equatorin into the aero some during spermatogenesis as revealed by super-resolution and immunoelectoron microscopy. (2013)
  • Author(s): 伊藤千鶴
  • Journal Title: Cell and Tissue Research Volume: 352 Pages: 739-750
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Galnt3 deficiency disrupts acrosome formation and leads to oligoasthenoteratozoos permia (2013)
  • Author(s): 宮崎 敏博
  • Journal Title: Histochemistry and Cell Biology Volume: 139 Issue: 2 Pages: 339-354
  • DOI: 10.1007/s00418-012-1031-3
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Unique structures of organelles observed in primary spermatocytes after micro-injection of protein solutions such as immunoglobulin into the lumen of the seminiferous tubules in mice and rats (2012)
  • Author(s): 外山 芳郎
  • Journal Title: Andrologia Volume: 9 Issue: 6 Pages: 402-408
  • DOI: 10.1111/and.12030
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Searching the enzyme responsible for molecular weight reduction of sperm acrosomal protein Equatorin during acrosome reaction (2015)
  • Author(s): Yamatoya K., Ito C., Maekawa M., Hatano M., Toshimori K.
  • Organizer: Proceedings of the 120th Annual Meeting of The Japanese Association of Anatomists and the 92nd Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
  • Place of Presentation: Kobe Convention Center (Kobe, Hyogo, Japan)
  • Year and Date: 2015-03-22
• [Presentation] Sperm acrosomal membrane complex analyzed by STED using Equatorin-EGFP transgenic mice (2015)
  • Author(s): Ito C., Yamatoya K., Maekawa M., Toshimori K.
  • Organizer: Proceedings of the 120th Annual Meeting of The Japanese Association of Anatomists and the 92nd Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
  • Place of Presentation: Kobe Convention Center (Kobe, Hyogo, Japan)
  • Year and Date: 2015-03-22
• [Presentation] Basigin interacts with monocarboxylate transporter 2 in the mouse testes and sperm (2015)
  • Author(s): Maekawa M., Cheng C., Yamatoya K., Ito C., Toshimori K.
  • Organizer: Proceedings of the 120th Annual Meeting of The Japanese Association of Anatomists and the 92nd Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
  • Place of Presentation: Kobe Convention Center (Kobe, Hyogo, Japan)
  • Year and Date: 2015-03-22
• [Presentation] Equatorin-mediated sperm-egg interaction (2015)
  • Author(s): Toshimori K., Ito C., Yamatoya K.
  • Organizer: Proceedings of the 120th Annual Meeting of The Japanese Association of Anatomists and the 92nd Annual Meeting of The Physiological Society of Japan
  • Place of Presentation: Kobe Convention Center (Kobe, Hyogo, Japan)
  • Year and Date: 2015-03-21
• [Presentation] SPESP1 ノックアウトマウスの先体反応に伴う先体タンパク質の局在と分子量変化 (2014)
  • Author(s): 大和屋健二、伊藤千鶴、年森清隆
  • Organizer: 第59回日本生殖医学会学術講演会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都・新宿区）
  • Year and Date: 2014-12-04 – 2014-12-05
• [Presentation] ODF2 isoform c の発現と運命 (2014)
  • Author(s): 伊藤千鶴、大和屋健二、年森清隆
  • Organizer: 第59回日本生殖医学会学術講演会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都・新宿区）
  • Year and Date: 2014-12-04 – 2014-12-05
• [Presentation] ヒト精子ミトコンドリアの形態異常と不妊症 (2014)
  • Author(s): 年森清隆、伊藤千鶴、大和屋健二
  • Organizer: 第59回日本生殖医学会学術講演会
  • Place of Presentation: 京王プラザホテル（東京都・新宿区）
  • Year and Date: 2014-12-04
• [Presentation] Analyses of sialylation status of sperm acrosomal protein Equatorin and enzyme responsible for molecular weight shift during acrosome reaction (2014)
  • Author(s): Yamatoya K., Ito C., Hatano M., Toshimori K.
  • Organizer: The 37th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
  • Place of Presentation: Pacifico Yokohama (Yokohama, Kanagawa, Japan)
  • Year and Date: 2014-11-27
• [Presentation] Sperm ODF2: analysis using ODF2-EGFP transgenic mice (2014)
  • Author(s): Toshimori K., Ito C., Yamatoya K.
  • Organizer: 18th International Microscopy Congress
  • Place of Presentation: Prague Congress Center (Prague, Czech Repblic)
  • Year and Date: 2014-09-07 – 2014-09-12
• [Presentation] 精子頭部のキャパシテーションと先体反応 (2014)
  • Author(s): 年森清隆、伊藤千鶴、大和屋健二
  • Organizer: 日本アンドロロジー学会第33回学術大会 第20回精子形成・精巣毒性研究会
  • Place of Presentation: 軽井沢プリンスホテルウエスト（長野県・軽井沢町）
  • Year and Date: 2014-06-12
• [Presentation] 精子先体赤道部糖タンパク質equatorinの糖鎖修飾変化に関わる酵素の探索 (2014)
  • Author(s): 大和屋 健二
  • Organizer: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 自治医科大学キャンパス(栃木県)
  • Year and Date: 2014-03-29
• [Presentation] トランスジェニックマウスを用いた精子ODF2の解析 (2014)
  • Author(s): 伊藤千鶴
  • Organizer: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 自治医科大学キャンパス(栃木県)
  • Year and Date: 2014-03-29
• [Presentation] マウス精子における膜タンパク質ベイシジン分子の特性 (2014)
  • Author(s): 前川眞見子
  • Organizer: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 自治医科大学キャンパス(栃木県)
  • Year and Date: 2014-03-29
• [Presentation] モノクローナル抗体MC101が認識する精子タンパク質の解析 (2014)
  • Author(s): 陳城
  • Organizer: 第119回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: 自治医科大学キャンパス(栃木県)
  • Year and Date: 2014-03-29
• [Presentation] Equatorinノックアウト雄マウスの受精現象 (2014)
  • Author(s): 年森清隆
  • Organizer: 新学術領域研究動植物に共通するアロ認証機構の解明 第8回領域会議
  • Place of Presentation: 名古屋大学東山キャンパス 野依記念学術交流会館(愛知県)
  • Year and Date: 2014-01-10
• [Presentation] 精子先体赤道部糖タンパク質equatorinの分子量低下に関わる酵素の探索 (2014)
  • Author(s): 大和屋健二
  • Organizer: 新学術領域研究動植物に共通するアロ認証機構の解明 第8回領域会議
  • Place of Presentation: 名古屋大学東山キャンパス 野依記念学術交流会館(愛知県)
  • Year and Date: 2014-01-09
• [Presentation] マウス精巣および精子におけるbasiginおよびその結合分子の解析 (2013)
  • Author(s): 前川眞見子
  • Organizer: 日本アンドロロジー学会第32回学術大会ならびに総会 および第19回精子形成・精巣毒性研究会共同開催学会
  • Place of Presentation: グランキューブ大阪(大阪府)
  • Year and Date: 2013-07-26
• [Presentation] 本当は怖い配偶子の老化-精子と卵子のアンチエイジング (2013)
  • Author(s): 伊藤千鶴
  • Organizer: 第13回日本抗加齢医学会総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • Year and Date: 2013-06-28
  • Invited
• [Presentation] 精子先体赤道部は、先体反応の過程でIZUM01のflip-flopによるN末端の露出の後、脆くなる (2013)
  • Author(s): 大和屋 健二
  • Organizer: 118回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: サンポート高松・かがわ国際会議場(香川県)
  • Year and Date: 2013-03-30
• [Presentation] EQT-EGFP transgenic mouseを用いたtime laps imagingと微細構造の対比による先体膜タンパク質equatorinの挙動解析 (2013)
  • Author(s): 年森 清隆
  • Organizer: 118回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: サンポート高松・かがわ国際会議場(香川県)
  • Year and Date: 2013-03-30
• [Presentation] 抗equatorin抗体はヒト先体マーカーとして有効である (2013)
  • Author(s): 伊藤 千鶴
  • Organizer: 118回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: サンポート高松・かがわ国際会議場(香川県)
  • Year and Date: 2013-03-30
• [Presentation] マウス精巣および精子における膜タンパク質ベイシジン分子の解析 (2013)
  • Author(s): 前川 眞見子
  • Organizer: 118回日本解剖学会総会・全国学術集会
  • Place of Presentation: サンポート高松・かがわ国際会議場(香川県)
  • Year and Date: 2013-03-30
• [Presentation] 精子先体赤道部タンパク質Equatorinの先体反応に伴う翻訳後修飾変化 (2013)
  • Author(s): 大和屋健二
  • Organizer: 第58回日本生殖医学会 学術講演会・総会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場神戸ポートピアホテル(兵庫県)
• [Presentation] 抗equatorin抗体を用いた精子の質の評価法の検討 (2013)
  • Author(s): 伊藤千鶴
  • Organizer: 第58回日本生殖医学会 学術講演会・総会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場神戸ポートピアホテル(兵庫県)
• [Presentation] 高解像顕微鏡およびSTEDを用いた受精関連タンパク質Equatoriの解析 (2013)
  • Author(s): 伊藤千鶴
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第69回学術講演会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク(大阪府)
• [Presentation] 抗perinuclear theca MN13抗体を使った新しい精子評価法 (2012)
  • Author(s): 伊藤 千鶴
  • Organizer: 第57回日本生殖医学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール、長崎新聞文化ホール(長崎県)
  • Year and Date: 2012-11-09
• [Presentation] 先体反応過程における精子膜と先体膜タンパク質の変化 (2012)
  • Author(s): 大和屋 健二
  • Organizer: 第57回日本生殖医学会総会・学術講演会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール、長崎新聞文化ホール(長崎県)
  • Year and Date: 2012-11-08
• [Presentation] Categorization of acrosome reaction and isolation of those sperm for biochemical analyses (2012)
  • Author(s): 大和屋 健二
  • Organizer: International Symposium on the Mechanisms of Sexual Reproduction in Animal and Plants. Joint Meeting of the 2nd Allo-authentication Meeting and the 5th Egg-Coat Meeting(MCBEEC)
  • Place of Presentation: Hotel Nagoya Garden Palace(名古屋)
• [Presentation] Subcellular and molecular events during mouse acrosome reaction mediated by fertilization-related protein equatorin (2012)
  • Author(s): 年森 清隆
  • Organizer: International Symposium on the Mechanisms of Sexual Reproduction in Animal and Plants. Joint Meeting of the 2nd Allo-authentication Meeting and the 5th Egg-Coat Meeting(MCBEEC)
  • Place of Presentation: Hotel Nagoya Garden Palace(名古屋)(招待講演)
• [Presentation] Equatorin (EQT) as a human sperm acrosome biomarker for the fertilization process (2012)
  • Author(s): 伊藤 千鶴
  • Organizer: International Symposium on the Mechanisms of Sexual Reproduction in Animal and Plants. Joint Meeting of the 2nd Allo-authentication Meeting and the 5th Egg-Coat Meeting(MCBEEC)
  • Place of Presentation: Hotel Nagoya Garden Palace(名古屋)
• [Book] Sexual Reproduction in Animals and Plants (2014)
  • Author(s): Ito C, Yamatoya K, Toshimori K.
  • Total Pages: 480
  • Publisher: Springer Japan