蛋白質相互作用の速度論的調節機構に関する構造細胞生物学的研究

• Project/Area Number: 12J30003
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 小山 昌子 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥3,960,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2012: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: CRM1 / Xpo1p / Yrb2p / Ran / 核細胞質間輸送 / X線結晶解析 / 反応速度論 / 核-細胞質間輸送 / Yrb2 / キネティクス解析 / 核膜孔 / Nup

Outline of Annual Research Achievements

Xpo1p (exportin 1, CRM1)は代表的なexportinであり、ロイシンリッチ核外輸送シグナル（NES）をもつ多様なcargoを核から細胞質へ一方向に輸送する。細胞内において輸送が効率的に行われるためには、核内でXpo1pがRanGTP依存的にcargoを積込む反応（核外輸送複合体の形成反応）が速やかに起こる必要がある。我々はこれまでに、核内に局在するRan結合蛋白質Yrb2pがXpo1p核外輸送複合体形成の反応速度を劇的に上昇させることを見出し、反応中間体に相当するXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体の結晶構造を2.22 A分解能で解いた。さらにXpo1p-cargo-RanGTP複合体（核外輸送複合体）の結晶構造も2.15 A分解能で解き、これらの構造比較からYrb2pによるXpo1p核外輸送複合体の形成促進機構のモデルを推測した。これまで、構造情報に基づいて作成した変異体を用いてin vitroおよびin vivoの検証実験を行いモデルを支持する結果を得てきたが、本年度はさらなる検証実験を行い、核内におけるYrb2pの作用機構を確立した。第一に、Yrb2pのRanBDがXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体から解離する反応のキネティクスを解析するための実験系を確立し、cargoがXpo1p-Yrb2p-RanGTP複合体に結合することによりYrb2pのRanBDの解離を促進することを明らかにした。また、出芽酵母の生細胞を用いてNuclear transport assayを行い、Yrb2pのFGリピートの機能的重要性を検証した。さらに、出芽酵母の生細胞内でYFP-Xpo1pとCFP-Yrb2p間で起こるFRETをacceptor photobleachingにより検出し、Xpo1pとYrb2pの核内における結合が、Xpo1pによるcargo核外輸送において重要であることを示した。以上の結果をまとめて、Cell Reports誌に論文を発表した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] CRM1核外輸送複合体の形成と解体の構造基盤の解明と創薬への応用 (2015)
  • Author(s): 小山昌子、松浦能行
  • Journal Title: 生化学 Volume: 87 Pages: 41-48
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural insights into how Yrb2p accelerates the assembly of the Xpo1p nuclear export complex (2014)
  • Author(s): Masako Koyama, Natsuki Shirai, and Yoshiyuki Matsuura
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 9 Issue: 3 Pages: 983-995
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2014.09.052
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Mechanistic insights from the recent structures of the CRM1 nuclear export complex and its disassembly intermediate (2012)
  • Author(s): Masako Koyama
  • Journal Title: BIOPHYSICS Volume: 8 Issue: 0 Pages: 145-150
  • DOI: 10.2142/biophysics.8.145
  • NAID: 130003310839
  • ISSN: 1349-2942
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 出芽酵母の核局在型Ran結合蛋白質Yrb2pが核外輸送受容体CRM1への積み荷積載反応をスピードアップする機構の構造基盤 (2014)
  • Author(s): 小山昌子、白井菜月、松浦能行
  • Organizer: 第32回染色体ワークショップ・第13回核ダイナミクス研究会
  • Place of Presentation: 広島県廿日市市
  • Year and Date: 2014-12-16
• [Presentation] 出芽酵母のRan結合蛋白質Yrb2pがXpo1p (CRM1)による核外輸送を促進する機構の構造基盤 (2014)
  • Author(s): 小山昌子、白井菜月、松浦能行
  • Organizer: 第87回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 京都府京都市
  • Year and Date: 2014-10-18
• [Presentation] 核内のRan結合蛋白質Yrb2がCRM1による核外輸送を促進する機構 (2013)
  • Author(s): 小山昌子
  • Organizer: 第32回染色体ワークショップ・第13回核ダイナミクス研究会
  • Place of Presentation: 神奈川県箱根
  • Year and Date: 2013-11-26
• [Presentation] アッセンブリーシャペロンが核外輸送を促進する機構の構造基盤 (2013)
  • Author(s): 小山昌子
  • Organizer: 新学術領域研究(構造細胞生物学)領域全体会議
  • Place of Presentation: 山梨県清里
  • Year and Date: 2013-06-20
• [Presentation] 核内のRan結合蛋白質Yrb2がCRM1による核外輸送を触媒的に促進する機構の構造基盤 (2012)
  • Author(s): 小山昌子
  • Organizer: 第85回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場(福岡県)
  • Year and Date: 2012-12-16
• [Presentation] Kinetic and X-ray crystallographic studies of assembly/disassembly of the CRMI nuclear export complex (2012)
  • Author(s): 小山昌子
  • Organizer: 第50回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2012-09-23