蛋白高次構造解析に向けた新規大量発現系の構築

• Project/Area Number: 13014222
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Japanese Foundation For Cancer Research
• Principal Investigator: 星川 裕 財団法人癌研究会, 癌研究所・遺伝子診断研究部, 研究員 (80280626)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 武久 ゲノムセンター, 研究員 (20342652)
• Project Period (FY): 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2001: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: アデノウイルス / ベクター / マススペクトロメトリー / 蛋白リン酸化

Research Abstract

1)アデノウイルスを用いたcDNAライブラリーの構築
ファージ遺伝子の組み換えシステムをアデノウイルス作製に応用することにより、容易に目的のウイルスの作製を可能とする系の開発を行った。具体的にはLiftech社のGatewayシステムをプラスミド型アデノウイルスベクターに組み込み、シャトルベクターのプロモーター領域には強力なCAGプロモーターを用いた。このシステムを用いることでコントロール遺伝子を容易にウイルスベクターに移し替えることが可能であった。しかし、このシステムではクローン遺伝子の載せ替えには有効であるが、ライブラリーのような遺伝子群の均一な組み換えが現時点では難しいために今後さらなる改良を必要であった。
2)マススペクトロメトリーを用いた細胞内シグナルの総合的解析システムの確立
情報伝達に関わる蛋白の機能的変化は数秒から数分間といった極めて短い時間で完遂し、次々に細胞内シグナルとして伝えられる。このようなシグナルを動的に捉えることを目的として、Surface Enhanced Laser Disorption(SELDI)TOF-MS法を用いて蛋白のリン酸化状態について定量的解析法の確立を行った。一般にリン酸化ペプチドは非リン酸化状態に比べ、イオン化しにくいことから合成リン酸化ペプチドを対照として用いて量の補正を行ったところ定量的な測定が可能であった。そこでこの系を用いて、具体的には培養細胞を材料として用い、p53分子について解析を行っている。