| Project/Area Number |
13017214
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
関根 政実 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助手 (70226653)
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| Project Period (FY) |
2001
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2001)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2001: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
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| Keywords | 細胞周期 / タバコ / Rb / サイクリン / E2F / 分化 / ユビキチン分解系 |
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| Research Abstract |
1.タバコサイクリンDの機能解析
昆虫細胞発現系により調製したタバコサイクリンD3がCdc2aと複合体を形成し、ヒストンH1とRbタンパク質をin vitroでリン酸化することを見い出した。また、タバコサイクリンDにGFPを融合させて、形質転換BY-2を作出し、細胞内局在性を解析した。野生型は核に局在するが、リン酸化部位変異体(T191A)は主に細胞質に局在することが分かった。T191Aを昆虫細胞発現系により調製したところ、Cdc2aと複合体を形成するがヒストンH1キナーゼ活性が低下し、サイクリンDの191番目のスレオニンが核への局在性とキナーゼ活性に必要であることが示唆された。次に、DNAヒストグラムを解析したところ、野生型の高発現によってG1期の細胞の割合が減少してS期の割合が増加し、タバコサイクリンD3がG1期からS期への移行を促進することが示唆された。また、グルココルチコイド誘導発現系を用いた実験系を確立し、リン酸化部位変異体(S296,300A)は野生型より安定だが、T191Aでは安定性が低いことが分かった。現在、他のタイプのサイクリンD3と供に、タバコRbの推定リン酸化部位を含むペプチドを合成して、各サイクリン/Cdc2a複合体の基質特異性を解析している。
2.タバコRbの機能解析
タバコRbにある13ケ所の推定リン酸化部位変異体を構築し、誘導発現系を用いて形質転換BY-2を作出した。誘導処理により細胞の成長が抑制されることが明らかになった。また、タバコRb抗体を作製し、Western解析によりBY-2細胞では植え継ぎ後5日目までは蓄積しているが、それ以降の増殖停止期では検出されないことが分かった。mRNAはどの時期でもほぼ同程度蓄積し、阻害剤を用いた解析により、Rbタンパク質が増殖停止期でユビキチン-プロテアソーム系によって分解されることが示唆された。また、[35S]メチオニンの取り込み後Rb抗体による免疫沈降により、増殖停止期でも新規合成は起こっていることが明らかになった。
3.タバコE2Fの機能解析
イネPCNAプロモーターをレポーターとした一過的な解析系により、タバコE2FがシロイヌナズナDPaと共発現することによって転写活性化が起きることが分かった。この系にタバコRbを発現させると量依存的にE2Fの転写活性化が抑制され、さらにサイクリンD3を発現させることによりRbによる抑制が回復することが示された。また、サイクリンA、BではRbの抑制が回復されないことから、サイクリンD3/Cdc2aによるRbのリン酸化が、RbによるE2Fの転写活性化の抑制からの回復に関与することが示唆された。
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