| Project/Area Number |
13022236
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥4,100,000 (Direct Cost: ¥4,100,000)
Fiscal Year 2002: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
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| Keywords | 分子シンクロナイゼーション / 分子間相互作用 / 酵素免疫測定法 / 酵素 / 抗体 / 臨床診断 / 食品分析 / ヒスタミン / 表面プラズモン共鳴法 / 生理活性アミン / 食中毒 |
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| Research Abstract |
ヒスタミン(HA)は神経伝達、胃液分泌、アレルギー反応に関与する生理活性アミンであり、食品衛生においては魚の鮮度マーカーである。分子シンクロナイゼーション系を組み込んだHAの高感度酵素免疫測定法EIAの構築を検討した。HAに対するモノクローナル抗体AHA2を獲得し、AHA2とHAとの相互作用を表面プラズモン共鳴法により解析した。AHA2の作出に用いた抗原HA-GA-BSAとAHA2との相互作用解離定数Kdは1nMであるが、HAとのKdは1μMであった。この差異はAHA2がHAと架橋剤GAとの結合部位をも認識する結果であると考えられた。HAにGAを共有結合させたHA-GAに対するAHA2の結合力は、HAに対する結合力に比べてl00倍増大したが、HA-GA-BSAの結合力に比べてかなり弱かった。AHA2と各種HA類縁体[His,α-methyl His,1-methylHA,3-methylHA, GABA]との交差反応性を検討した。AHA2はこれら類縁体とほとんど相互作用を示さなかった。一方、昨年度開発した3酵素反応シンクロ系を改良して、化学発光検出系を用いる4酵素系を構築した。ALP(酵素1)標識した第2抗体によりNADPからNADを生成させ、第2酵素ADHによりNADをNADHに変換する。ついで第3酵素NHRによりNADHをNADに変換するとともにFMNをFMNH_2に還元する。FMNH_2は第4酵素ルシフェラーゼによりFMNに変換されるが、このとき脂肪酸アルデヒドが脂肪酸に変換され化学発光を発する。以上のシンクロ系の最適化を検討し、ほぼ応用できる条件を見出すことができた。
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