Group II型シャペロニン及びその補因子プレフォルディンの構造解析

• Project/Area Number: 13033008
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大河内 美奈 東京農工大学, 工学部, 助手 (70313301)
• Project Period (FY): 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2002: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2001: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: シャペロニン / シャペロン / プレフォルディン / 古細菌 / 超好熱性菌 / フォールディング / X線結晶構造解析 / 酵母 / CCT / ストレス応答 / 結晶

Research Abstract

我々は、超好熱性古細菌由来Group II型シャペロニン、プレフォルディンを用いて、構造学的にGroup II型シャペロニンのBuild-in Lid開閉機構及びシャペロニンとプレフォルディンの協調機構の解明を目的に研究を行っている。
様々なヌクレオチド存在下で、野生型αシャペロニンにproteinase Kを作用させたところ、ATP, AMP-PNP存在下では分解が妨げられた。また、アピカルドメインの先端にTrp残基を導入した変異体を作成し、構造変化をその蛍光特性から追跡した。その結果、ATP, AMP-PNPと結合したシャペロニンにおいて蛍光の増大が観測された。これらの結果は、ATPとの結合に伴い、Built-in Lidが閉じることを示唆するものだと思われる。一方、リフォールディング活性を示さない変異体αシャペロニンを用いた際には、この構造変化を示す結果は得られなかった。Built-in LidのDeletion Mutantを作成したところ、変性タンパク質結合能は有していたが、タンパク質フォールディング活性は失われていた。このDeletion Mutantの結晶を得ることに成功した。
プレフォルディンはWild型の結晶から良いDiffractionが得られないことから、βサブユニットのC末8残基欠失体の結晶化を試み20%PEG 4000、0.1M HEPES(pH7.7)の条件で結晶が得られた。しかし、この結晶からも構造解析に使える反射を得ることは出来なかった。シャペロニンとの共結晶の作成を試みたが結晶は得られていない。
また、酵母由来プレフォルディンの各サブユニットの発現系を作成し、全てのサブユニットを組み込んだ同時生産系を構築した。

Research Products

• [Publications] Okochi, M., Yoshida, T., Maruyama, T., Kawarabayasi, Y., Kikuchi, H., Yohda, M.: "Pyrococcus prefoldin stabilizes protein-folding intermediates and transfers them to chaperonins for correct folding"Biochem Biophys Res Commun. 291. 769-774 (2002)
• [Publications] Shomura, Y., Yoshida, T., Maruyama, T., Yohda, M., Mild, K.: "Crystallization and preliminary X-ray characterization of archaeal group II chaperonin alpha-subunit from Thermococcus strain KS-1"Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58. 1830-1832 (2002)
• [Publications] Yoshida, T., Ideno, A., Suzuki, R., Yohda, M., Maruyama, T.: "Two kinds of archaeal group II chaperonin subunits with different thermostability in Thermococcus strain KS-1"Mol Microbiol. 44. 761-769 (2002)
• [Publications] Yoshida, T., Kawaguchi, R., Taguchi, H., Yoshida, M., Yasunaga, T., Wakabayashi, T., Yohda, M.Maruyama, T.: "Archaeal group II chaperonin mediates protein folding in the cis-cavity without a detachable GroES-like co-chaperonin"J Mol Biol. 315. 73-85 (2002)
• [Publications] 吉田尊雄, 養王田正文, 丸山正: "古細菌の分子シャペロンの世界"蛋白質 核酸 構造. 48. 33-39 (2003)
• [Publications] Iizuka, R. et al.: "Glycine at the 65th position plays an essential role in ATP dependent protein folding by archaeal groupII chaperonin"Biochem.Biophys.Res.commun.. 289. 1118-1124 (2001)
• [Publications] Yoshida, T et al.: "Archaeal gourpII chaperonin mediates protein folding in the cis-cavity without a detachable GroES-like co-chaperonin"J.Mol.Biol.. 315. 73-85 (2002)
• [Publications] Okochi, M. et al.: "Pyrococcus prefoldin stabilizes protein-folding intermediates and transfers their chaperonins for correct folding"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 291. 769-774 (2002)