| Project/Area Number |
13033026
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
山縣 ゆり子 熊本大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (40183678)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土井 健史 大阪大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (00211409)
池水 信二 熊本大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (60333522)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥3,700,000 (Direct Cost: ¥3,700,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2001: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 巨核球分化 / 蛋白質の大量調製 / 蛋白質の結晶化 / 3次元構造 / 染色体凝縮 / 蛋白質-蛋白質相互作用 |
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| Research Abstract |
血液中に存在する種々の血球は骨髄の造血幹細胞から分化する。その中でも血小板の前駆細胞である巨核球への分化、成熟の分子機構は、最もわかっていない研究領域である。本年度は、特に未分化な造血系組織に特異的に産生され、シグナル伝達系によく見られるリン酸化可能な配列を多くもち、巨核球への分化、細胞分裂(染色体の凝縮)に重要な役割を果たしていると推定されるヒトDRF-1(分子量約12万)に集中して結晶化を行い、X線構造解析法で3次元構造を決定し、DRF-1の機能解明を目指した。本年度の研究状況は以下の通りである。
(1)ヒトDRF-1の大腸菌からの大量調製系の確立に成功していたので、本年度も引き続き、その確立した方法で数mgの蛋白質を高純度に精製し、結晶化条件の検討を行っている。特に本年度はタンパク溶液に微量に含まれる低分子化合物の除去を徹底して行い、結晶化条件の探索を行っているが、現在のところ結晶は得られていない(山縣)。
(2)全長蛋白質の結晶化をあくまで追求しつつ、同時に大腸菌内在性のプロテアーゼによる精製蛋白質の分解を調べたところ、N末から主に2万と9万の蛋白質が比較的安定に得られることがわかった。そのうち2万のドメイン蛋白質を純度よく精製できたので、これについても結晶化を行っているが、現在のところ良好な結晶は得られていない(山縣)。
(3)大腸菌から精製したヒトDRF-1は、可溶化剤による可溶化、巻き戻しのステップを通っているので、天然の三次元構造をもつはずの動物細胞からのDRF-1を精製、大腸菌からのものと比較することを目的にどの細胞でDRF-1が高発現かを調べCOS7細胞中の発現が多いことが判っていたのでCOS7細胞を培養し、DRF-1の精製を試みている(山縣、土井)。
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