真核生物複製フォークの染色体複製およびゲノム安定性維持における役割

• Project/Area Number: 13214057
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 和賀 祥 大阪大学, 生命機能研究科, 助教授 (60222402)
• Project Period (FY): 2001 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥34,300,000 (Direct Cost: ¥34,300,000); Fiscal Year 2004: ¥7,900,000 (Direct Cost: ¥7,900,000); Fiscal Year 2003: ¥8,700,000 (Direct Cost: ¥8,700,000); Fiscal Year 2002: ¥9,000,000 (Direct Cost: ¥9,000,000); Fiscal Year 2001: ¥8,700,000 (Direct Cost: ¥8,700,000)
• Keywords: DNA複製 / ゲノム安定性 / Werner症候群 / DNAポリメラーゼ / ウエルナー症候群 / Bloom症候群 / DNAポリメラーゼδ / Xenopus卵抽出液 / replication fork arrest / DNAポリメラーゼε / 複製因子 / DNAヘリカーゼ / ウェルナー症候群 / アフリカツメガエル

Research Abstract

真核生物のDNA複製の分子機構の解明を通じて、ゲノム安定性維持のメカニズムを理解することを目標に研究を進めた。特に本研究では、ゲノム不安定化を特徴とする遺伝病Werner症候群のの原因遺伝子産物WRNヘリカーゼのDNA代謝における機能を明らかにすることを目的に、アフリカツメガエル卵DNA複製系を利用した生化学的な解析を進めた。これまでに、WRNとともに複製因子PolδやRPAのクロマチンへの結合が複製進行の一時停止に伴って特異的に増加することを見いだしている。このクロマチン結合の定量解析の結果、通常の複製時には低レベルのWRNのクロマチン結合しか見られないが、ポリメラーゼ阻害剤による複製停止に伴い、それまでに形成されていた複製フォークの数に相当する分子数のWRNがクロマチンに結合することが示された。
そこで、特異的抗体でWRNを除去した卵抽出液を調製し、複製進行阻害を引き起こすMMSで前処理したクロマチン鋳型を使った複製あるいは低濃度のポリメラーゼ阻害剤存在下での複製を行ったが、WRN除去による顕著な影響は見られなかった。ところが、MMS無処理および阻害剤非存在下の複製においてWRN除去した場合にヒストンH2AXの顕著なリン酸化が検出された。さらに、その際のDNA合成量もWRN除去によってわずかに低下した。以上の結果から、WRNは正常の複製時においても重要な働きをしており、その破綻はゲノムの不安定化に導く可能性が考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Distinct roles of DNA polymerases delta and epsilon at the replication fork in Xenopus egg extracts (2004)
  • Author(s): Tomoyuki Fukui
  • Journal Title: Genes to Cells 9 Pages: 179-191
• [Journal Article] DNA複製と染色体不安定性 (2004)
  • Author(s): 和賀 祥
  • Journal Title: 医学のあゆみ 208・10 Pages: 805-810
• [Publications] Asako Furukohri: "Identification and characterization of a Xenopus homolog of Dbf4, a regulatory subunit of the Cdc7 protein kinase required for the initiation of DNA replication"Journal of Biochemistry. 134. 447-457 (2003)
• [Publications] Tomoyuki Fukui: "Distinct roles of DNA polymerases delta and epsilon at the replication fork in Xenopus egg extracts"Genes to Cells. in press. (2004)
• [Publications] Waga, S., et al.: "DNA polymerase ε is required for coodinated and efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98. 4978-4983 (2001)
• [Publications] Ola, A., et al.: "Human-Saccharomyces cerevisiae proliferating cell nuclear antigen hybrids"J. Biol. Chem.. 276. 10168-10177 (2001)