ノックアウトマウスを用いたRasファミリータンパク質の機能解析

• Project/Area Number: 13216116
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo (2002-2004); National Center of Neurology and Psychiatry (2001)
• Principal Investigator: 服部 成介 東京大学, 医科学研究所, 寄付研究部門教員(常勤形態) (50143508)
• Project Period (FY): 2001 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥40,400,000 (Direct Cost: ¥40,400,000); Fiscal Year 2004: ¥9,700,000 (Direct Cost: ¥9,700,000); Fiscal Year 2003: ¥9,700,000 (Direct Cost: ¥9,700,000); Fiscal Year 2002: ¥10,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000); Fiscal Year 2001: ¥11,000,000 (Direct Cost: ¥11,000,000)
• Keywords: Ras / Gap1m / ノックアウトマウス / Rap1 / ERK / p38 MAPキナーゼ / プロテオミクス / GTPase / Chat / MAPキナーゼ / ファイブロネクチン / 細胞接着

Research Abstract

Rasファミリー因子の個体内機能を明らかにする目的で、以下の実験を行なった。Ras抑制性因子Gap1^mノックアウトマウスの作成に関して、組換えアレルを有するES細胞クローンを複数作成し、キメラマウスの作成を行なった。しかし変異アレルをもったF1マウスを研究期間内のうちに得ることができなかった。またカルシウムシグナリングに応答するsmall GTPase Rinのノックアウトマウスを作成したが、顕著な形質変化は見いだせていない。
Rasファミリー因子の標的因子として、多くのタンパク質キナーゼが活性化され、さらにシグナルを伝達していくことが示されている。そこで、これらのキナーゼが関与するシグナル伝達系の全貌を明らかにすべく、金属キレートカラムを用いたリン酸化タンパク質の精製と2次元ゲル電気泳動を組合わせることにより、ERKシグナル伝達系の構成因子であるMEK、ERK、RSKの活性化を可視化した。さらに新規ERK基質と考えられる因子の同定を行ない、当該因子が細胞中でERKによりリン酸化されることを明らかにした。これらのERK基質を試験管内でリン酸化し、さらにリン酸化ペプチドを質量分析器で構造解析することにより、基質リン酸化部位の同定を行った。同様のアプローチをp38 MAPキナーゼ系にも応用し、p38 MAPキナーゼカスケードの中でリン酸化される基質を網羅的に検索した。その結果、p38 MAPキナーゼによってリン酸化を受けて活性化されるMAPKAPK-2の基質であるBAG2タンパク質を同定し、そのリン酸化部位を決定した。

Research Products

• [Journal Article] Proteomic identification of Bcl-2 assocated athanogene 2 as a novel MAPK-activated protein kinase 2 substrate (2004)
  • Author(s): Ueda, K.et al.
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry 279 Pages: 41815-41821
• [Journal Article] JNK promotes Bax translocation to mitochondria through phosphorylation of 14-3-3 proteins (2004)
  • Author(s): Tsuruta, F.et al.
  • Journal Title: EMBO Journal 23 Pages: 1889-1899
• [Publications] Yunoue, S.et al.: "Neurofibromatosis type I tumor suppressor neurofibromin regulates neuronal differentiation via its GTPase-activating protein function toward Ras."J.Biol.Chem.. 278. 26958-26969 (2003)
• [Publications] Tsuruta, F.et al.: "JNK promotes Bax translocation to mitochondria through phosphorylation of 14-3-3 proteins."EMBO J.. (印刷中). (2004)
• [Publications] Sakakibara A, Hattori S, Nakamura S, Katagiri T.: "A novel hematopoietic adaptor protein, Chat-H, positively regulates T cell receptor-mediated interleukin-2 production by Jurkat cells"J.Biol.Chem.. 278. 6012-6017 (2003)
• [Publications] Sakakibara A, Ohba Y, Kurokawa K, Matsuda M, Hattori S.: "Novel function of Chat in controlling cell adhesion via Cas-Crk-C3G-pathway-mediated Rap1 activation"J.Cell Sci.. 115. 4915-4924 (2002)
• [Publications] Iida, N., Namikawa, K., Kiyama, H., Ueno, H., Nakamura, S., Hattori S.: "Requirement of Ras for the activation of mitogen-activated protein kinase by calcium influx, cAMP, and neurotrophin in hippocampal neurons"J. Neurosci.. 21巻17号. 6459-6466 (2001)