| Project/Area Number |
13750734
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
生物・生体工学
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
河原崎 泰晶 (河原崎 泰昌) 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助手 (80303585)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2001: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Keywords | 無細胞蛋白質合成系 / 小麦胚芽抽出液 / 単鎖抗体 / ヒト血清アルブミン / 高速多検体検索系 / 進化工学的機能改良 / カルボキシペプチダーゼ / アフィニティータグ / 大規模発現検索 / scFv / 進化工学的機能改変 / ハイスループット スクリーニング |
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| Research Abstract |
ヒト血清アルブミン(HSA)は、糖尿病の初期マーカー蛋白質である。HSAを特異的に認識するモノクローナル抗体に由来する単鎖抗体(single chain Fv, scFv) anti-HSA scFvは、糖尿病の初期診断薬としての利用が期待される有用抗体である。
まず、小麦胚芽抽出液を用いた無細胞蛋白質合成系における活性型anti-HSA scFvの発現の効率化について種々の検討を行った。この検討の中で、(1)合成系内では合成産物のC末端が非常に不安定であり、合成直後に分解されること、(2)分解には小麦胚芽中のcarboxypeptidaseが関与していること、(3)carboxipeptidaseの特性、を明らかにし、C末端の分解を防ぐことに成功した。この一連の成果は、原著論文としてJ. Biotechnol. Bioeng.誌に掲載された。
次に系内で生産されたanti-HSA scFvの活性化条件について検討した。この結果、(1)scFvの70%以上は可溶性蛋白質として生産される、(2)抗原結合能の増大には、酸化的な条件となるよう翻訳反応終了液を希釈・酸化する必要がある、等の知見が得られた。活性化された単鎖抗体は効率よく抗原分子と結合し、簡便な検出系で検出可能であった。
次にフォールディング能向上変異体の取得を目的とした検討を行った。scFv遺伝子全領域にわたってランダム変異を導入し、緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質として大腸菌内で発現させ、より強い蛍光シグナルを与えるscFv変異体を取得した。現在、これらの変異体から高い抗原結合能を保持しているものを選び、これらを鋳型として再び変異導入を行い、無細胞蛋白質合成系を用いた迅速発現系により結合速度が増大したクローンを検索している(未発表)。
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