LIMPII、ユビキチン融合インフルエンザDNAワクチンによる免疫応答と感染防御

• Project/Area Number: 13770155
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Virology
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 長谷川 秀樹 国立感染症研究所, 感染病理部, 主任研究官 (30301790)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2002: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2001: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: インフルエンザウイルス / 免疫応答 / 感染防御 / DNAワクチン / ユビキチン / MHC class I / hemagglutinin(HA) / neuraminidase(NA)

Research Abstract

1、LIMP II融合インフルエンザHA DNAワクチンの作成
マウス線維芽細胞NIH3T3細胞より得らたcDNAライブラリーを用いマウスLIMP IIの遺伝子の単離を行った。C'末端にLIMP IIのライソゾームターゲットシークエンスを融合させる形でインフルエンザウイルスのHA及びNAのDNAワクチンを作成した。C'末端にLIMP IIのtailを融合させる事により発現されたワクチン抗原はMHC class IIを介する抗体誘導の増強が期待される。
2、ユビキチン融合及びLIMP II融合インフルエンザDNAワクチンの発現と細胞内動態
作成したユビキチン融合及びLIMP II融合インフルエンザDNAワクチンを293T細胞に導入し、ウエスタンブロッティングにて発現を確認、及び蛍光抗体法を用い細胞内での局在を調べた。また、細胞内での動態を調べるためにS35メチオニンラベルした細胞を用いパルスチェース法を用い蛋白発現後の時間的動態を解析した。結果、ウエスタンブロッティングでのワクチン抗原の発現確認ではHAのDNAワクチンでは強い発現が確認されたがHA-LIMP IIでは少量の発現が、Ub-HAではほとんど抗原が見られなかった。しかしパルスチェイス法では3種類のワクチン共に発現がみられ特にHAでの発現が多く又Ub-HAでは発現後速やかに分解されている事がわかった。この結果はユビキチンの融合によりワクチン抗原がプロテオソームに運ばれ速やかに分解されている事が示唆される。
3、HA, Ub-HA, HA, LIMP II DNAワクチンの抗体応答の比較
作成した3種のインフルエンザHAワクチンを用いマウスにエレクトロポレーション法を用いて接種しHA特異的抗体をELISA法を用いて測定した。マウス大腿の筋肉内に1〜10μgのDNAワクチンを接種し100V6回のパルスでエレクトロポレーションを行った。3週間隔で2回免疫しさらに2週後の血清、鼻腔洗浄液を回収しIgA, IgGを測定した。この条件での抗体応答はHA 10μgで行ったものが最も高くそれは抗原の発現量に比例していた。モディファイしたDNAワクチンの発現量を増やす工夫が必要である。

Research Products

• [Publications] Hasegawa H^*, Kadowaki S, Aizawa H, Takahashi H, Iwasaki T, Tamura S, Kurata T, Sata T.: "Persistent influenza virus infection of irradiated mice and its prevention by intranasal vaccination"Vaccine. 20. 1050-1057 (2002)
• [Publications] OgawaGoto K, Irie S, Omori A, Hasegawa H, Sata T, Kurata T, Arao Y.: "An endoplasmic reticulum protein, p180, binds to human cytomegalovirus through an interaction with a tegment protein encoded by UL48"Journal of Virol. 76. 2350-2362 (2002)
• [Publications] Asahi Y, Yoshikawa T, Watanabe I, Iwasaki T, Hasegawa H, Sato Y, Shimada S, Nanno M, Matsuoka Y, Ohwaki M, Iwakura Y, Suzuki Y, Aizawa C, Sata T, Kurata T, Tamura S.: "Protection against influenza virus infection in poly-Ig receptor-knockout mice immunized intranasally with adjuvant-combined vaccines"Journal of Immunology. 168. 2930-2938 (2002)
• [Publications] Takahashi H, Sawa H, Hasegawa H, Shoya Y, Sata T, Hall WW, Nagashima K, Kurata T.: "Topoisomerase I and ATP activate cDNA synthesis of human immunodeficiency virus type 1"Biochem Biophys Res Commun. 294. 509-517 (2002)
• [Publications] Takahashi H, Sawa H, Hasegawa H, Sata T, Hall WW, Nagashima K, Kurata T.: "Reconstitution of cleavage of human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) RNAs"Biochem Biophys Res Commun. 293. 1084-1091 (2002)
• [Publications] Takahashi H, Sawa H, Hasegawa H, Sata T, Hall W, Kurata T.: "Binding and dissociation of human topoisomerase I with hairpin-loop RNAs : implications for the regulation of HIV-1 replication"Biochem Biophys Res Commun.. 297. 593-599 (2002)
• [Publications] Hasegawa H, Tatsumi M, Ogawa-Goto K, Takahashi H, I wasaki T, Kurata T, Sata T, Takeuchi T, Sheehy N, Sawa H, Nagashima K, Hall WW: "Processing of the HTLV-IJ envelope precursor glycoprotein, gp63 by furin is essential for cell fusion activity"AIDS Research and Human Retroviruses. 18. 1253-1260 (2002)
• [Publications] Katano K, Ogawa-Goto K, Hasegawa H Kurata T, Sata T: "Human-Herpesvirus-8-Encoded K8 Protein Colocalizedes with the Promyolocytic Leukemia Protein(PML)Bodies and Recruits p53 to the PML bodies"Virology. 286. 446-455 (2001)
• [Publications] Hasegawa H, Kadowaki S, Aizawa H, Takahashi H, Iwasaki T, Tamura S, Kurata T, Sata T: "Persistent infection of influienza virus in irradiated mice and its prevention by intranasal vaccination"Vaccine. 20. 1050-1057 (2002)
• [Publications] Ogawa-Goto K, Irie S, Omori A, Miura Y, Katano H, Hasegawa H, Kurata T, Sata T, Arao Y: "An Endoplasmic Reticulum Protein, p180, Is Highly Expressed in Human Cytomegalovirus-Permissive Cells and Interacts with the Tegument Protein Encoded by UL48"Journal of Virology. 76. 2350-2362
• [Publications] Asahi Y, Yoshikawa T, Watanabe I, Iwasaki T, Hasegawa H, Sato Y, Shimada S, Nanno M, Matsuoka Y, Ohwaki M, Iwakura Y, Suzuki Y, Aizawa C, Sata T, Kurata T, Tamura S: "Protection against influenza virus infection in poly-Ig receptor-knockout mice immunized intranasally with adjuvant-combined vaccines"Journal of Immunology. (印刷中). (2002)