歯科領域における遺伝子治療の基礎実験について

• Project/Area Number: 13771153
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 補綴理工系歯学
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 飯田 俊二 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (30281827)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 2002: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2001: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: OPG / 破骨細胞 / RANK

Research Abstract

歯科領域において、歯牙が欠損した後の顎骨の保全は重要な課題であり、顎骨量は補綴処置等の難易・のちのQOLを左右する因子と考えられる。そこで骨吸収を抑制することで、骨量維持・骨形成促進させることを目標に、骨代謝調節に重要であるといわれているOsteoprotegerin(OPG)に着目し、遺伝子治療を見据えたOPG発現ベクターの開発を試みた。平成13年度にはmouse OPG(mOPG)部分断片cDNAをクローニングし、in vitro蛋白質発現系の構築を行なっていた。平成14年度に新たにmOPGの全長cDNAを松本歯科大・宇田川教授より供与を受け、プライマーの設計を再び行なう。テンプレートはpT7Blue-mOPGとし、pyrobestを用いPCRを行いPCR産物を得た。その後PCR産物をフェノール・クロロフォルム処理を行なうことにより精製した。この精製したOPGcDNAと動物細胞発現用ベクターを酵素であるBamH1にて処理をし,その後QIAEXIIによるビーズ処理をし、電気泳動で確認。そしてここでligationを行い大腸菌(DH5α)にDNAを導入した。DNA導入された大腸菌をLA plateに播種し、colonyの出現を確認。そのおのおののcolonyをmini prepにてDNA導入の成否を確認。導入されていた大腸菌のみを再度LA plateに播き出現したcolonyをLA-broth 100ml入ったフラスコで大量培養を行なう。オーバーナイトで培養後、MARUGEN社のHIGH PURITY MAXIPREPにて精製を行い、OPG plasmid DNAを大量に回収。電気泳動にてプラスミドDNAの確認を行なう。まず株化osteosarcoma(MG63)を導入対象細胞に選択し、蛍光プラスミドとしてGFPを用いBoehringer mannhem社FuGENE 6 Transfection reagentによりOPGを導入。24時間後、蛍光顕微鏡にて蛍光発色を起こしている細胞を確認した。結果導入効率は20%程であた。次に初代ヒト歯根膜線維芽細胞を用いたところ5%程の効率であった。このため導入効率、発現安定性を考慮しレトロウイルスベクターにより導入することが適切と考えmOPG発現レトロウイルスベクターの構築を行なった。現在細胞培養系・個体への導入を行なう段階である。