化学的組継ぎ法により作成したリン酸化Max蛋白質の機能と構造に関する研究

• Project/Area Number: 13780479
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 堀内 正隆 北海道大学, 大学院・薬学研究科, 助手 (90322825)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2002: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2001: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: DNA結合蛋白質 / リン酸化 / 核磁気共鳴 / 構造生物学

Research Abstract

平成14年度は,昨年度に得られた化学的組継ぎ法により作成したリン酸化Max蛋白質のNMR測定データの解析を進めた.化学的組継ぎ法により作成したリン酸化Max蛋白質は,そのアミノ末端側に安定同位体標識されていない化学合成リン酸化ペプチド由来の領域をもち,カルボキシル末端側に15N安定同位体標識された組換え蛋白質由来の領域をもつキメラ蛋白質である.この化学的組継き蛋白質について,15N同位体フィルターTOCSYを適用すれば,主に化学合成ペプチド領域に由来するアミドプロトンとそれらと相関したスピン系に属するプロトン群のスペクトルが観察できるはずである.実際に15N同位体フィルターTOCSYスペクトルを測定したところ,予想されるアミノ酸に該当するプロトンのうち,アミノ末端のメチオニン以外のスピン系,すなわちリン酸化セリン,アスパラギン酸,アスパラギン,イソロイシン,グルタミン酸,バリン及びアラニンを同定することができた.次に15N同位体フィルターNOESYを適用したところ,先のTOCSYスペクトルと交差する複数のNOESYスペクトルが観察されたので,アミノ酸の連鎖帰属を試みた.現時点ではいくつかのNOESYスペクトルが見つかっていないのだが,全12アミノ酸残基のうち8アミノ酸残基分の連鎖帰属に成功した.現在,スペクトルの同定に見落としがないか,またより良好なNOESYスペクトルが得られないかどうか検討を進めている.さらに側鎖の同定及び立体構造決定に必要な13C/15N二重安定同位体標識あるいは重水素化された組換え体の作成も進めている.

Research Products

• [Publications] Toru Kawakami: "Polypeptide synthesis using an expressed peptide as a building block for condensation with a peptide thioester"Journal of Peptide Science. 7. 474-487 (2001)