| Project/Area Number |
13780483
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Structural biochemistry
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
大塚 正人 岡山大学, 薬学部, 助手 (30243489)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
Fiscal Year 2002: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000)
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| Keywords | センサーロドプシン / 膜タンパク質 / 大量発現 |
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| Research Abstract |
以下の項目の研究を行い、以下の結果を得た。
これまでに確立したSR IIの大量発現系をもとに、Htr IIのハロバクテリアにおける機能的な大量発現系の確立を行なった。ハロバクテリアの野生株ゲノム遺伝子より、Htr IIをコードする遺伝子htr IIをflanking領域を含めてクローニングし、発現ベクターに導入した。このプラスミドを用いて、4種のロドプシンを完全に欠損した変異体を宿主としHtr IIの大量発現系を構築した。具体的にはプロモーターとしてBRのプロモーターである、bopプロモーターを用い、その下流にhtr IIをつなぐことで過剰発現できた。Htr IIの大量発現系では、2種の発現ベクターを作成した。即ち、Htr IIをBRのleader sequenceと融合させたものとleader sequenceと融合させていないものである。これらの形質転換体を単離後、発現量の差異について検討した。組み換え蛋白質の精製を簡略化するために、同蛋白質のカルボキシル基末端には6つのヒスチジンオリゴマーを融合させた。大量発現されたHtr IIは可溶化後、Ni-NTA Agaroseを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。また、SR IIとHtr IIを同時に過剰発現させる系をハロバクテリア中で構築した。大量発現した蛋白質はHtr IIの場合と同様に精製・単離した。現在、得られたタンパク質を用いてSR II及びHtr IIの3次元結晶を作成中である。
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