| Project/Area Number |
13780567
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Cell biology
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
伊藤 俊樹 東京大学, 医科学研究所, 助手 (30313092)
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| Project Period (FY) |
2001 – 2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 2001: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | epsin / トランスゴルジ網 / クラスリン / ENTHドメイン / AP-1 / イノシトールリン脂質 / エンドサイトーシス / インシトールリン脂質 / エンドソーム |
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| Research Abstract |
昨年度の本研究において明らかにした、新規epsinファミリーに属するKIAA0171のさらに詳細な機能解析を行った。
KIAA0171の細胞内局在は、クラスリンだけでなく、トランスゴルジ網(TGN)輸送に関与するアダプタータンパク、AP-1と一致した。また、その一部はエンドソームの融合によって生じるMVB(multi-vesicular body)構造の周縁部に沿って局在することが観察された。実際、in vitroでのpull-down assay及びoverlay assayにより、KIAA0171は一次構造中央部においてクラスリン重鎖、及びγ-adaptinと結合することが明らかとなった。さらに詳細な部分コンストラクトを作製し、検討したところ、これらの結合はそれぞれ、(1)KIAA0171の「SGDLVDLSGDLVDLGFVG」配列とクラスリン重鎖末端ドメイン、及び(2)KIAA0171の「GNGDFGDWSA」配列とγ-adaptinのearドメインとの相互作用によるものであることが明らかとなった。
次に、KIAA0171の細胞内局在とENTHドメインの関係を明らかにするべく、さまざまな変異型コンストラクトをGFP融合タンパクとしてCOS7細胞内に発現し、その細胞内局在を検討した。ENTHドメインを欠損するとKIAA0171のTGN周辺への局在が観察されないことは昨年度に明らかにしていたが、脂質結合に必須の67番ArgをAlaに置換した変異体も同様に、細胞質中に分散する異常な局在パターンを示した。驚くべきことに、ENTHドメインのみをGFP融合タンパクとして発現させると単独でTGNに局在できることが観察され、その局在は67番Arg変異型ENTHドメインでは観察されなかった。
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