PNAを用いた腎尿細管培養細胞内mRNA発現調節・解析システムの開発

• Project/Area Number: 13877163
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Kidney internal medicine
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 根東 義明 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (00221250)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 根東 義則 東北大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (90162122) ; 藤原 幾磨 東北大学, 医学部・附属病院, 助手 (10271909)
• Project Period (FY): 2001
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2001)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2001: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
• Keywords: PNA / FITC / 尿細管 / イオン輸送 / mRNA

Research Abstract

まず、本研究で用いるPNAの合成に関して、固相合成を用いるPNA合成の自動合成法を検討した。本研究の分担研究者の根東はヘテロ環化合物を中心とした生理活性小分子の固相自動合成について、ACT496という合成機を用いて検討しており、技術的には対応可能であったが、まだ細部においては最適化が必要である。固相合成については、修飾核酸に関連してデアザプリンのモデルとしてインドール誘導体の合成研究も行った。また、合成機を用いずにより簡便に合成するためにマルチピン法を用いるPNA合成法を確定した。
つぎに、蛍光プローブであるFITCを分子内に導入して、その細胞内への取り込みを正確にモニターする方法については、PNAの細胞膜の透過性を評価するために有用であることが明らかとなった。今回の研究では、腎尿細管細胞を直接用いることは結果的にできなかったが、細胞株を利用し、検討を加えた。HEK細胞(ヒト胎児腎細胞由来細胞株)に修飾核酸キュウーオシンの合成酵素HuTGTをコードする遺伝子のアンチセンス(FITC-O-ATGCCGCTCTACTCCG-O-Lys)およびセンス(FITC-O-TCCCCATTTTACAGTA-O-Lys)の細胞内への導入を検討し、蛍光顕微鏡下でFITCの蛍光をもとに透過性の評価と生理機能解析を行なっている。いずれも細胞膜を透過しにくい傾向が見られたため、細胞内への核酸導入試薬であるFuGENE6とともに処理し改善が見られた。さらに標的タンパクの発現抑制およびPNAの細胞毒性の評価を行なっている。細胞株の種類によってPNAの透過性が異なることも明らかとなった。