遺伝子導入法を用いたヒト破骨細胞の形態・機能解析法の確立

• Project/Area Number: 13877306
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Morphological basic dentistry
• Research Institution: Kyushu Dental College
• Principal Investigator: 後藤 哲哉 九州歯科大学, 歯学部, 助教授 (70253458)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 輝男 九州大学, 歯学研究院, 教授 (60077667) ; 中牟田 信明 九州歯科大学, 歯学部, 助手 (00305822) ; 小林 繁 九州歯科大学, 歯学部, 教授 (10118078)
• Project Period (FY): 2001 – 2002
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2002)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2002: ¥600,000 (Direct Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2001: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: HL-60 / 遺伝子導入 / electroporation / 破骨細胞 / actin / pEGF / in vitro / 機能解析

Research Abstract

本研究においてはまず、in vitroで確実にヒト破骨細胞を形成させる方法の確立を行った。破骨細胞の前駆細胞としてはヒト単球のcell lineであるHL-60を用いた。HL-60をRPMI1640培養液に、活性型ビタミンD_3、M-CSF、RANKLを加えさらに20%のFCSを加えて2週間培養して酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ(TRAP)染色を行った。その結果、5種類のロットのFCSのうち2種類のもので多核の破骨細胞が形成された。HL-60細胞は培養7日目で融合を始め、多核化し、培養10日目ころからTRAP陽性細胞が認められた。以後、破骨細胞の形成にはこの系を用いることとした。
遺伝子導入はまず、Clontech社のactin融合pEGFPベクターを用いた。HL-60細胞への遺伝子導入にはelectroporation法を用いた。種々の細胞濃度および電圧で遺伝子導入を行い、もっとも効率の良かった条件で以後のelectroporationを行った。Actin融合pEGFベクターを導入したHL-60細胞はG418添加の培養液によりクローニングを行った。こうしてできたActin融合pEGFベクター導入HL-60細胞を用い上記の破骨細胞分化条件で培養を行った。その結果、Actin融合pEGFベクター導入HL-60細胞でもTRAP陽性の破骨細胞の形成が認められた。次年度は、このActin融合pEGFベクター導入破骨細胞を用いて破骨細胞の機能解析を行う予定である。