ニューロン変性や細胞死の早期兆候を知る(lacZ-EM法)

Research Project

Project/Area Number	13878159
Research Category	Grant-in-Aid for Exploratory Research
Allocation Type	Single-year Grants
Research Field	Nerve anatomy/Neuropathology
Research Institution	Kansai Medical University
Principal Investigator	杉本哲夫関西医科大学, 医学部, 教授 (90144352)
Project Period (FY)	2001
Project Status	Completed (Fiscal Year 2001)
Budget Amount *help	¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000) Fiscal Year 2001: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Keywords	lacZ / β-ガラクトシダーゼ / ノックアウトマウス / ニューロン変性
Research Abstract	ニューロン死の機序を明らかにすることは脳病態を解明する上で意義が大きい。成熟脳において特定のニューロンの変性を来すノックアウトマウスに着目し、ニューロン死の早期兆候を知る方法の開発を企図した。ニューロン変性や細胞死は一定の週齢以降に誘発されるため、幼弱期において脳のlacZ発現細胞を電子顕微鏡下に観察した。発現しているlacZをβ-ガラクトシダーゼ組織化学法により高感度検出する方法を確立した。方法の特色を下に列記した。これまでのlacZ検出法は主にlacZが過剰発現している遺伝子変異マウスの細胞においてなされているが、本法はノックアウトマウスにおいてターゲット遺伝子をlacZカセットにより置換した例にも適用し得たため、より高感度で実用的な方法と考えられた。今回用いたlacZ-EM法の特色(概要):1.パラフォルムアルデヒド潅流固定(グルタールアルデヒドは検出感度低下を来すので省略した)。2.X-gal反応(Houtani et al.,J.Comp.Neurol.,424(3)489-508,2000による)。3.後固定(グルタールアルデヒドとオスミウムを使用)。4.脱水(プロピレンオキシドは検出感度低下を来すので省略した)。ノシセプチン受容体遺伝子欠損マウス(ホモ接合体)の視床下部腹内側核にて本法を適用したところ、細胞体に高電子密度の顆粒が局在しているニューロンを明瞭に識別することが可能であった。