高密度マイクロフルーイディックストレージによる高速有用微生物探索デバイスの開発

• Project/Area Number: 13J01428
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied microbiology
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 佐々 文洋 筑波大学, 生命環境系, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥4,320,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2015: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: 微生物 / 培養デバイス / MEMS / スクリーンニング / 単離 / 微小ゲル / 画像解析 / 国際研究者交流(米国) / 培養 / ゲル / マイクロマシンニング / アレイ

Outline of Annual Research Achievements

従来の新規有用微生物探索を目的とした環境サンプルのスクリーニング研究の多くは、シャーレやウェルプレートを用いて、単離・培養・分析を行ってきた。しかし、この方法では同時に処理できる培養数は数百程度に限られる。そこで本研究では、マイクロマシンニング技術を用いることで、１プレートあたり１万単位の独立した長期微生物培養および単菌レベルの微量な代謝物の検出の実現を目的としたアレイ型培養デバイスを作製した。デバイスは、円形のガラス基板(φ3 inch,厚さ500 μm)を基板とし、フォトリソグラフィーによって形成された80 μm角の孔が約10万個アレイ状に並んだ樹脂層を持つ。脂層の上面は超撥水処理（接触角130°）が施されており、各孔には独立にLB寒天培地が充填されている。密度を適切に調整した菌懸濁液をデバイスに導入することにより、各ゲルにそれぞれ0個から数個程度の菌が播種され、確率的な一括した単離が可能となる。ゲルの持つ保水性によりわずか5 nLでありながら、培地の蒸発を抑え長時間の培養が可能となる。
最終年度では、作製したアレイ型培養デバイスをリアルタイムで培養観察可能な顕微鏡-培養環境定常化装置を開発し、タイムラプス動画像の取得に成功した。また、得られた動画像からグロースカーブおよびそこから得られる１チャンバーごとの成長情を抽出するためのコンピュータ画像解析を開発し1000単離菌体規模の常食と気勢を一括して評価することに成功した。さらに菌が増殖した特定のゲルに対し、実体顕微鏡、およびニードルを固定した電動ステージによる、半自動での１ゲルのピックアップに成功した。本ストレージデバイスは当初計画していた液滴によるアレイを試行錯誤の上で改良し、液滴を液体ではなくゲル培地とすることで、単離培養密度を当初目標の1平方センチメートル当たりに33個から3096個することに成功、当初目標の約100倍の高密度化を実現している。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Electrochemical Bubble-Based Bidirectional Microfluidic Transport (2016)
  • Author(s): H. Obata, T. Kuji, K. Kojima, F. Sassa, M. Yokokawa, K. Takekoshi, H. Suzuki
  • Journal Title: ACS Sensors Volume: 1 Issue: 2 Pages: 190-196
  • DOI: 10.1021/acssensors.5b00059
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ナノリットルでOK．液滴による化学分析 (2015)
  • Author(s): 佐々文洋
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 93 Pages: 158-158
• [Journal Article] ナノリットルでOK．液滴による化学分析 (2015)
  • Author(s): 佐々文洋
  • Journal Title: 生物工学会誌(総説) Volume: 93 Pages: 158-158
  • Open Access
• [Presentation] Programmable droplet processing device for bio/chemical analysis (2016)
  • Author(s): Fumihiro Sassa, Kenshi Hayashi, Hiroaki Suzuki
  • Organizer: EMN meeting on Droplets 2016
  • Place of Presentation: San Sebastian, Spain
  • Year and Date: 2016-05-10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 微量液滴操作技術と生物/化学ＭＥＭＳ (2015)
  • Author(s): 佐々文洋
  • Organizer: 第2回「鉄鋼材料の生物劣化を誘導する影響因子の解明」自主フォーラム研究
  • Place of Presentation: 産業技術総合研究所,茨城県・つくば市
  • Year and Date: 2015-11-26
  • Invited
• [Presentation] 半導体メモリのように化学物質を展開・格納可能なオンデマンド化学ライブラリーチップ (2015)
  • Author(s): 佐々文洋, Klavs F. Jensen
  • Organizer: 第32回「センサ･マイクロマシンと応用システム」シンポジウム
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ、新潟県・新潟市
  • Year and Date: 2015-10-28
• [Presentation] 100,000個規模のマイクロ培養ゲルアレイと画像解析による微生物スクリーニングシステム (2013)
  • Author(s): 佐文洋, 清川達則, 濱田将風, 稲葉知大, 尾花望, 長田啓司, 横川雅俊, 豊福雅典, 鈴木博章, 野村暢彦
  • Organizer: 2013年度バイオフィルムと複合微生物系研究会
  • Place of Presentation: 宇都宮大学
  • Year and Date: 2013-12-07
• [Presentation] 微生物スクリーニングを目的とした高密度単離培養マイクロゲルアレイ (2013)
  • Author(s): 佐々文洋, 清川達則, 濱田将風, 稲葉知大, 尾花望, 横川雅俊, 豊福雅典, 鈴木博章, 野村暢彦
  • Organizer: 第29回日本微生物生態学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター
  • Year and Date: 2013-11-23
• [Presentation] ゲル充填マイクロ孔アレイによる微生物の高密度単離培養 (2013)
  • Author(s): 佐々文洋, 清川達則, 濱田将風, 稲葉知大, 尾花望, 横川雅俊, 豊福雅典, 鈴木博章, 野村暢彦
  • Organizer: 第30回「センサ・マイクロマシンと応用システム」シンポジウム, 仙台国際センター
  • Place of Presentation: 仙台国際センター
  • Year and Date: 2013-11-06
• [Book] ソフト・ドリンク技術資料／№177 (2015)
  • Author(s): 稲葉知大，尾花望，清川達則，吉田圭太朗，佐々文洋，尾形敦，野村暢彦
  • Total Pages: 22
  • Publisher: 全国清涼飲料工業会
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞培養用デバイス (2014)
  • Inventor(s): 野村暢彦, 鈴木博章, 佐々文洋, 清川達則, 横川雅俊, 豊福雅典, 尾花望, 濱田将風, 稲葉知大
  • Industrial Property Rights Holder: 筑波大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2014-01-22