人工ヌクレアーゼを用いた標的遺伝子組換えメダカ作出技術の確立

• Project/Area Number: 13J01682
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Genetics/Genome dynamics
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 安齋 賢 京都大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000); Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2014: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2013: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: メダカ / ゲノム編集 / CRISPR/Cas / TALEN / ヌクレアーゼ / 標的遺伝子組換え / CRISPR / 相同組換え

Outline of Annual Research Achievements

DNAシークエンス技術の発達に伴い、ゲノム情報の整備が急速に進む中、個々の遺伝子の機能を個体レベルで詳細に解析するための逆遺伝学的手法の重要性は増大しつつある。本研究では、任意のゲノムDNAを切断可能な人工ヌクレアーゼを用いて、メダカでの胚における標的遺伝子組換え技術を確立することを目的とした。本年度は前年度に引き続き、CRISPR/Casシステムによる標的遺伝子組み換えの高効率化のための条件検討を行った。
本研究では、骨格筋特異的に強く発現するOlMA1遺伝子への標的遺伝子組換えによるGFP遺伝子の導入をモデル実験として、導入効率の比較検討を進めた。始めに、特に再現性において問題となった部分として、ドナーDNAへのRNaseの混入、及び転写RNAへのDNaseの混入の2点について、それぞれProteinase処理の追加や精製キットの変更を行った。続いて、必要な各核酸の導入量や導入に用いるドナーベクター中の相同配列の長さ、相同配列を露出させるためのBait配列について、導入効率に及ぼす影響を比較検討し、ある程度効率的に標的遺伝子組換えを行うためのプロトコルを確立しつつある。現在、当初計画の通り、更なる相同組換え効率の上昇を期待して、DNA二重鎖切断修復に関わる分子の操作についても検討を進めている。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Chronic fluoxetine treatment induces anxiolytic responses and altered social behaviors in medaka, Oryzias latipes (2016)
  • Author(s): Satoshi Ansai, Hiroshi Hosokawa, Shingo Maegawa, Masato Kinoshita
  • Journal Title: Behavioural Brain Research Volume: 303 Pages: 126-136
  • DOI: 10.1016/j.bbr.2016.01.050
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] An Essential Role of the Arginine Vasotocin System in Mate-Guarding Behaviors in Triadic Relationships of Medaka Fish (Oryzias latipes). (2015)
  • Author(s): Yokoi S, Okuyama T, Kamei Y, Naruse K, Taniguchi Y, Ansai S, Kinoshita M, Young LJ, Takemori N, Kubo T, Takeuchi H
  • Journal Title: PLoS Genetics Volume: なし Issue: 2 Pages: e1005009-e1005009
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005009
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Viable neuronopathic Gaucher disease model in medaka (Oryzias latipes) displays axonal accumulation of alpha-synuclein (2015)
  • Author(s): Norihito Uemura, Masato Koike, Satoshi Ansai, Masato Kinoshita, Tomoko Ishikawa-Fujiwara, Hideaki Matsui, Kiyoshi Naruse, Naoaki Sakamoto, Yasuo Uchiyama, Takeshi Todo, Shunichi Takeda, Hodaka Yamakado, Ryosuke Takahashi
  • Journal Title: PLoS Genetics Volume: 11 Issue: 4 Pages: 1-14
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1005065
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Targeted mutagenesis using CRISPR/Cas system in medaka (2014)
  • Author(s): Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
  • Journal Title: Biology Open Volume: 3 Issue: 5 Pages: 362-371
  • DOI: 10.1242/bio.20148177
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Design, evaluation, and screening methods for efficient targeted mutage nesis with TALENs' in medaka. (2014)
  • Author(s): S. Ansai, K. Inohaya, Y. Yoshiu ra, M. Schartl, N. Uemura, R. Takahashi, M. Kinoshita
  • Journal Title: Development, Growth & Differentiation Volume: 56 Issue: 1 Pages: 98-107
  • DOI: 10.1111/dgd.12104
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Behavioral alterations in medaka caused by serotonin deficiency in the raphe neurons (2016)
  • Author(s): Satoshi Ansai, Hiroshi Hosokawa, Shingo Maegawa, Youhei Washio, Kenji Sato, Masato Kinoshita
  • Organizer: 3rd Medaka Strategic Meeting/17th Australia and New Zealand Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: フリンダーズ（オーストラリア）
  • Year and Date: 2016-02-01
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] PhiC31インテグレースによる高効率遺伝子導入に用いるLanding site (attP) 導入メダカ系統の樹立 (2015)
  • Author(s): 石川 時郎, 安齋 賢, 岡田 徹也, 木下 政人, 森 和俊
  • Organizer: 21th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 大阪大学銀杏会館（大阪府吹田市）
  • Year and Date: 2015-09-19
• [Presentation] Behavioral phenotyping test battery for genetically modified fish (2014)
  • Author(s): Satoshi Ansai, Shingo Maegawa, Masato Kinoshita, Hiroshi Hosokawa
  • Organizer: 20th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2014-09-22
• [Presentation] 遺伝子改変メダカの行動特性解析のための行動テストバッテリーの開発 (2014)
  • Author(s): 安齋 賢, 前川 真吾, 木下 政人, 細川 浩
  • Organizer: 日本動物学会第85回仙台大会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2014-09-11
• [Presentation] Efficient method for targeted mutagenesis in medaka using TALENs and CRISPR/Cas system (2014)
  • Author(s): Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
  • Organizer: 11th International Conference on Zebrafish Development and Genetics
  • Place of Presentation: Madison, WI
  • Year and Date: 2014-06-24 – 2014-06-28
• [Presentation] Efficient and simple method for targeted mutagenesis in medaka using TALENs and CRISPR/Cas system (2014)
  • Author(s): Satoshi Ansai, Masato Kinoshita
  • Organizer: 2nd Strategical Meeting for Medaka Research
  • Place of Presentation: Sevilla, Spain
  • Year and Date: 2014-04-10 – 2014-04-12
• [Presentation] CRISPR/Casシステムを利用したメダカにおける簡便・高効率な標的遺伝子破壊 (2013)
  • Author(s): 安齋賢, 木下政人
  • Organizer: 第36回本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸国際展示場(兵庫県神戸市)
  • Year and Date: 2013-12-05
  • Invited
• [Presentation] TALEN及びCRISPR/Casを用いた標的遺伝子破壊メダカ作出技術の開発 (2013)
  • Author(s): 安齋賢, 木下政人
  • Organizer: 第10回水生動物の行動と神経系シンポジウム
  • Place of Presentation: 鹿児島大学理学部(鹿児島県鹿児島市)
  • Year and Date: 2013-11-30
  • Invited
• [Presentation] CRISPR/Casシステムによる遺伝子破壊メダカの作出 (2013)
  • Author(s): 安齋賢, 木下政人
  • Organizer: 日本動物学会第84回岡山大会
  • Place of Presentation: 岡山大学津島キャンパス(岡山県岡山市)
  • Year and Date: 2013-09-27
  • Invited
• [Presentation] CRISPR/Cas system-an efficient and simple tool for targeted genome editing in medaka (2013)
  • Author(s): S. Ansai, M. Kinoshita
  • Organizer: 19th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
  • Place of Presentation: 仙台市情報・産業プラザ(宮城県仙台市)
  • Invited
• [Book] Targeted genome editing using site-specific nucleases (2015)
  • Author(s): Atsuo Kawahara, Taijiro Yabe, Satoshi Ansai, Shinji Takada, Masato Kinoshita
  • Total Pages: 205
  • Publisher: Springer
• [Book] 実験医学別冊 最強のステップUPシリーズ今すぐ始めるゲノム編集TALEN&CRISPR/Cas9の必須知織と実験プロトコール (2014)
  • Author(s): 山本卓, 佐久間哲史, 落合博, 木下政人, 安齋賢, 久野悠, 川原敦雄, 他(計45名)
  • Total Pages: 205
  • Publisher: 羊土社
• [Remarks] 研究者代表者個人ホームページ
  • URL: http://www.mbf.marine.kais.kyoto-u.ac.jp/~ansai/cv.html