キチン系バイオマスの有効利用をめざした構造生物学：キトサン加水分解酵素

• Project/Area Number: 13J03639
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied biochemistry
• Research Institution: Kinki University
• Principal Investigator: 新家 粧子 近畿大学, 農学研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2014: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2013: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 糖質結合モジュール / キチン / キトサン / キトサナーゼ / NMR溶液構造

Outline of Annual Research Achievements

真菌類細胞壁に含まれるキチンおよびキトサンの有効利用を促進するため、構造生物学的手法によりキトサナーゼに存在するキトサン結合モジュール（DD1,DD2）の立体構造を明らかにし、キトサン認識機構を解明することを目的とした。DD1およびDD2の立体構造は、核磁気共鳴(NMR)法を用いた溶液構造解析により明らかにした。大腸菌発現系を用いて得られた13Cおよび15NラベルDD1、DD2を用い、1H-15N HSQCおよび3次元スペクトルの測定を行い、主鎖シグナルの帰属を行った。つづいて、1H-13C HSQC、HCCH-TOCSY、CCH-TOCSYの測定を行い、側鎖シグナルの帰属を行った。さらに、NOESYスペクトルの測定を行い、NOEを帰属し、CYANAプログラムによって構造計算を行った。その結果、DD1とDD2ともに、2枚のbetaシートからなるbetaサンドウィッチ構造を有し、その上下に突き出すようにいくつかのループ構造が存在することが明らかになった。さらにNMRを用いたキトサンオリゴ糖の滴定実験の結果、キトサンはDD1とDD2のbetaサンドウィッチ構造の上部のループ領域に結合することがわかった。また、結合に関与するアミノ酸残基の比較を行ったところ、DD１の36番目のグルタミン酸残基がDD2ではチロシン残基に置換していることがわかった。そこで、このアミノ酸残基について、DD1のグルタミン酸残基をチロシンに変異させたDD1-E36Yおよび、DD2のチロシン残基をグルタミン酸に変異させたDD2-Y36Eを作製し、キトサン結合実験を行った結果、DD1ではGlu36のチロシンへの変異が親和性大きく低下させ, また, DD2のTyr36のグルタミン酸への変異が親和性の増大をもたらした。以上のように、部位特異的変異によってCBMのリガンド特異性のコントロールが可能であることが示唆された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Interaction of di-N-acetylchitobiosyl moranoline with a family GH19 chitinase from moss, Bryum coronatum. (2014)
  • Author(s): Shinya, S., Urasaki, A., Ohnuma, T., Taira, T., Suzuki, A., Ogata, M., Usui, T., Lampela, O., Juffer, AH., Fukamizo, T.
  • Journal Title: Glycobiology Volume: 24 Issue: 10 Pages: 945-955
  • DOI: 10.1093/glycob/cwu052
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of a "loopless" GH 19 chitinase in complex with chitin tetrasaccharide spanning the catalytic center. (2014)
  • Author(s): Ohnuma, T., Umemoto, N., N agata, T., Shinya, S., Numata, T., Taira, T, Fukamizo, T.
  • Journal Title: Biochemca et Biophysica Acta Volume: 1844 Issue: 4 Pages: 793-802
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2014.02.013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mutation strategies for obtaining chitooligosaccharides with longer chains by transglycosylation reaction of family GH18 chitinase. (2014)
  • Author(s): Sirimontree, P., Suginta, W., Srinrho, N., Kanda, Y., Shinya, S., Ohnuma, T., Fukamizo, T
  • Journal Title: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Volume: 78 Issue: 12 Pages: 2014-2021
  • DOI: 10.1080/09168451.2014.948373
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Production of chitooligosaccharides from Rhizopus oligosporus NRRL2710 cells by chitosanase digestion. (2014)
  • Author(s): Mahata, M., Shinya, S., Masaki, E., Yamamoto, T, Ohnum a, T., Brzezinski, R., Mazumder, T. K., Yamashita, K., Narih iro, K., Fukamizo, T.
  • Journal Title: Carbohydrate research Volume: 383 Pages: 27-33
  • DOI: 10.1016/j.carres.2013.06.002
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structures of the catalytic domain of a novel glycohydrolas e family 23 chitinase from Ralstonia sp. A-471 reveals a unique a rrangement of the catalytic residues for inverting chitin hydrolysis. (2013)
  • Author(s): Arimori, T., Kawamoto, N., Shinya, S., Okazaki, N., Nakazawa, M., Miyatake, K., Fukamizo, T., Ueda, M., Tamada, T.
  • Journal Title: The journal of biological chemistry Volume: 288 Issue: 26 Pages: 18696-706
  • DOI: 10.1074/jbc.m113.462135
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The first identication of carbohydrate binding modules specific to chitosan. (2013)
  • Author(s): Shinya, S., Ohnuma, T., Yamashiro, R., Kimoto, H., Kusaoke, H., Anbazhagan, P., Juffer, A. H., Fukamizo, T
  • Journal Title: The journal of biological chemistry Volume: 288 Issue: 42 Pages: 30042-63
  • DOI: 10.1074/jbc.m113.503243
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Chitosan-binding modules (CBM32) of a chitosanase from Paenbacillus sp. IK-5 (2014)
  • Author(s): Shoko Shinya, Shigenori Nishimura, Hisashi Kimoto, Hideo Kusaoke, Takayuki Ohnuma, Tamo Fukamizo
  • Organizer: Mie Bioforum 2014
  • Place of Presentation: Ise-Shima, Japan（三重県志摩市）
  • Year and Date: 2014-11-19
• [Presentation] Paenibacillus sp. IK-5 キトサナーゼに存在するキトサン結合モジュール (DD1)のNMR溶液構造とキトサン結合に関与するアミノ酸残基 (2014)
  • Author(s): 新家粧子、尾井宏美、大沼貴之、木元 久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 日本応用糖質科学会平成26年度大会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター（新潟県新潟市）
  • Year and Date: 2014-09-24
• [Presentation] オリゴ糖結合がキトサン結合モジュールの熱安定性へ及ぼす影響 (2014)
  • Author(s): 新家粧子、尾井宏美、大沼貴之、木元 久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 第28回キチン・キトサンシンポジウム
  • Place of Presentation: 順天堂大学（東京都文京区）
  • Year and Date: 2014-08-07
• [Presentation] Chitosan-binding modules (CBM32) of a chitosanse from Paenbacillus sp. IK-5 --- Amino acid residues responsible for chitosan binding--- (2014)
  • Author(s): Shoko Shinya, Takayuki Ohnuma, Hisashi Kimoto, Hideo Kusaoke, Tamo Fukamizo
  • Organizer: 28th annual symposium of the protein society
  • Place of Presentation: SanDiego, USA
  • Year and Date: 2014-07-28
• [Presentation] Paenibacillus sp. IK-5 キトサナーゼのCBM32キトサン結合モジュール－リガンド結合に関与するアミノ酸残基－ (2014)
  • Author(s): 新家粧子、尾井宏美、大沼貴之、西村重徳、木元 久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 第15回関西グライコサイエンスフォーラム第15回関西グライコサイエンスフォーラム
  • Place of Presentation: 大阪市立大学（大阪府大阪市）
  • Year and Date: 2014-05-24
• [Presentation] Paenibacillus sp. IK-5由来新規キトサン特異的糖質結合モジュールのキトサンオリゴ糖結合様式 (2013)
  • Author(s): 噺家粧子、大沼貴之、山城玲奈、Padmanabhan Anbazhagan、Andre H. Juffer、木元久、草桶秀夫、深溝慶
  • Organizer: 日本応用糖質科学会平成25年度大会
  • Place of Presentation: 鹿児島大学(鹿児島県)
  • Year and Date: 2013-09-25
• [Presentation] Paenibacillus sp. IK-5由来新規キトサン特異的糖質結合モジュールのキトサンオリゴ糖結合様式 (2013)
  • Author(s): 新家粧子, 大沼貴之, 山城玲奈, Padmanabhan Anbazhagan, André H. Juffer, 木元久, 草桶秀夫, 深溝慶
  • Organizer: 日本農芸化学会関西・中四国・西日本支部合同大会
  • Place of Presentation: 広島大学(広島県)
  • Year and Date: 2013-09-06
• [Presentation] Binding Mode of Chitosan Oligosaccharides to Novel Chitosan-Spe cific Carbohydrate-Binding Modules (CBM32) of a Chitosanase from Paenibacillus sp. IK-5 (2013)
  • Author(s): Shinya, S., Ohnuma, T., Yamashiro, R., Anbazhagan, P., Juffer, A. H., Kimoto, H., Kusaok e, H., Fukamizo, T.
  • Organizer: 12th International conference on chitin and chitosan
  • Place of Presentation: ポルト(ポルトガル)
  • Year and Date: 2013-05-06