ＰＰＲ蛋白質を利用した標的ＲＮＡ特異的改変システムの開発

• Project/Area Number: 13J04569
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Living organism molecular science
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 八木 祐介 九州大学, 農学研究院, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥4,320,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2015: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2014: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2013: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: RNA / PPR / RNA分解 / ヌクレアーゼ / タンパク質工学 / 葉緑体 / ミトコンドリア

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、植物のみで非常に拡大したRNA結合蛋白質ファミリーであるPPR蛋白質に着目し。その特性を利用することで様々なRNA配列に結合する人工RNA結合蛋白質を構築し、RNaseをそれと融合することで標的特異的な細胞内RNA分解系を作成しようというものである。昨年度までに、1. 動物培養細胞を用いたPPR蛋白質とRNAの結合の検出システム、2.任意RNA配列に結合するPPR蛋白質の作成方法について確立できた。現状では成功確率は低いが、完成したカスタムPPR蛋白質を用いて、RNA分解酵素や翻訳抑制因子のようなエフェクタードメインを連結し、細胞内mRNAの翻訳抑制手法の構築を目標に今年度は研究を行った。まず、既知の様々なRNase domainや翻訳抑制因子などをcloningし、それらと昨年度作成したPPR蛋白質を融合し、reporter assayを用いてRNA分解、翻訳抑制効果を検証した。その結果、最大で50%程の標的蛋白質の抑制効果が見られた。さらに、翻訳抑制可能なドメインのスクリーニングが完了したので、実際に内在遺伝子を標的でき、発現抑制が可能なカスタムPPR蛋白質を作成した。その結果、内在mRNAに対しても検証を行い、20-30%程度ではあるが、抑制効果が見られた。今後、PPRと抑制ドメイン間のリンカー配列の検討や、PPR蛋白質の発現安定性などを改良し最適化することで、さらに機能的な人工RNaseが作成できると考えている。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Development of genome engineering tool(s) by plant specific PPR proteins using animal cultured cell (2016)
  • Author(s): T. Kobayashi, Y. Yagi, T. Nakamura.
  • Journal Title: Methods in Mol. Biol Volume: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] PPRモチーフを用いたDNA/RNA操作技術 (2016)
  • Author(s): 八木祐介、中村崇裕
  • Journal Title: 科学評論社「内分泌・糖尿病・代謝内科」 Volume: 印刷中
• [Journal Article] The potential for manipulating RNA with pentatricopeptide repeat proteins (2014)
  • Author(s): Y. Yagi., N. Nakamura., I. Small
  • Journal Title: The Plant Journal Volume: (in press) Issue: 5 Pages: 870-882
  • DOI: 10.1111/tpj.12377
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recent advances in the study of chloroplast gene expression and its evolution (2014)
  • Author(s): Y. Yagi., T. Shiina
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: (in press)
  • DOI: 10.3389/fpls.2014.00061
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Heterogeneity of the 5'-end in plant mRNA may be involved in mitochondrial translation (2013)
  • Author(s): T. Kazama., Y. Yagi., K. Toriyama., T. Nakamura
  • Journal Title: Frontiers in Plant Science Volume: 4 Pages: 1-4
  • DOI: 10.3389/fpls.2013.00517
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Two DYW subclass PPR proteins are involved in RNA editing of ccmFc and atp9 transcripts in the moss Physcomitrella patens : first complete set of PPR editing factors in plant mitochondria (2013)
  • Author(s): Mizuho Ichinose, Chieko Sugita, Yusuke Yagi, Takahiro Nakamura, Mamoru Sugita
  • Journal Title: Plant Cell Physiology Volume: 54 Issue: 11 Pages: 1907-1916
  • DOI: 10.1093/pcp/pct132
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pentatricopeptide repeat proteins involved in plant organellar RNA editing. (2013)
  • Author(s): Y. Yagi., M. Tachikawa., H. Noguchi., S. Satoh., J. Obokata., T. Nakamura
  • Journal Title: RNA biology Volume: 10 Issue: 9 Pages: 1419-1425
  • DOI: 10.4161/rna.24908
  • Peer Reviewed
• [Presentation] PPRタンパク質を利用した標的特異的なmRNA翻訳制御ツールの開発 (2016)
  • Author(s): 八木祐介、中村崇裕
  • Organizer: 植物生理学会
  • Place of Presentation: 岩手
  • Year and Date: 2016-03-18
• [Presentation] PPR蛋白質を利用した標的mRNA特異的な翻訳制御ツールの開発 (2015)
  • Author(s): 八木祐介、中村崇裕
  • Organizer: 分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01
• [Presentation] 植物オルガネラ遺伝子発現制御因子であるPPR蛋白質のRNA認識機構 (2015)
  • Author(s): 八木祐介、中村崇裕
  • Organizer: 第４回植物RNA研究者ネットワークシンポジウム
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2015-01-19 – 2015-01-20
• [Presentation] PPRモチーフを用いたRNA操作技術の開発 (2014)
  • Author(s): 八木祐介、中村崇裕
  • Organizer: 第４回ゲノム編集研究会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2014-10-06 – 2014-10-07
• [Presentation] PPR motifas a new DNA/RNA binding module for genome editing (2014)
  • Author(s): 八木祐介、佐久間哲史、山本卓、中村崇裕
  • Organizer: 第55回日本植物生理学会
  • Place of Presentation: 富山大学
  • Year and Date: 2014-03-18
• [Presentation] ゲノム編集の新しいDNA/RNA結合モジュール、PPRのモチーフ (2013)
  • Author(s): 八木祐介、佐久間哲史、山本卓、中村崇裕
  • Organizer: 第36回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2013-12-04
• [Presentation] 任意配列に結合するカスタムRNA結合蛋白質の開発 (2013)
  • Author(s): 八木祐介、中村崇裕
  • Organizer: 第15回日本RNA学会
  • Place of Presentation: 愛媛大学
  • Year and Date: 2013-07-25