内在性受容体の特異的ｏｎ ｃｅｌｌケミカルラベリングと時空間的機能解析

• Project/Area Number: 13J04988
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Chemistry related to living body
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 三木 卓幸 京都大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2015: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2014: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2013: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: タンパク質 / ラベル化 / プロテオミクス / 亜鉛イオン / 膜タンパク質 / タンパク質ラベル化 / 蛍光イメージング / pulse chase解析 / live cell / タンパク質分解 / 膜蛋白質 / 蛋白質ラベル化 / pulse-chase解析 / on cell / 蛋白質分解

Outline of Annual Research Achievements

Zn(II)に応答性を有するラベル化剤を開発し、Zn(II)条件的なproteomicsを考案し、実証した。Zn(II)イオンは細胞内外でシグナル伝達物質として働ことが示唆されており、動的に局在が変化する。Zn(II)シグナル伝達に関わる蛋白質を調べる手法は従来、総括的な解析ではなかった。申請者は、Zn(II)シグナル伝達に関わるタンパク質を総括的に調べる手法として、ケミカルラベル化を応用した新しい”conditional プロテオミクス”を開発した。これは、有機化学的手法によって、生細胞中の高濃度Zn(II)環境下に存在している蛋白質を選択的にラベル化する。ラベル化蛋白質を細胞破砕後に精製し、LC-MS/MS解析によって同定する方法である。まず、申請者はZn(II)との結合によって反応が活性化するラベル化剤”AIZin”を開発した。これは、蛋白質のラベル化に有用な求電子反応基Acyl Imidazole にdipicolylamine を連結した分子である。ルイス酸性の強いZn(II)の配位により、アシル転移反応の脱離基であるImidazoleの電子密度が低下することで、活性化し、蛋白質表面上の求核性アミノ酸残基と反応をする。C6細胞に対して一酸化窒素(NO)刺激を加えると、一時的に細胞内のZn(II)濃度が急激に上昇し、未知なvesicleに貯蔵される。AIZinラベル化剤をC6細胞に投与すると、NO刺激後に多数の蛋白質がラベル化された。ラベル化蛋白質を免疫沈降法によって精製し、トリプシンでpeptide断片化、LC-MS/MS解析を行った。その結果、未知なzinc-rich vesicleに存在する蛋白質を同定することができた。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Extended Affinity-guided DMAP Chemistry with Finely-tuned Acyl Donor for Intracellular FKBP12 Labeling (2015)
  • Author(s): Zhining Song, Yousuke Takaoka, Yoshiyuki Kioi, Kazuhiro Komatsu,Tomonori Tamura, Takayuki Miki, Itaru Hamachi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 44 Issue: 3 Pages: 333-335
  • DOI: 10.1246/cl.141065
  • NAID: 130004868396
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] LDAI-Based Chemical Labeling of Intact Membrane Proteins and Its Pulse-Chase Analysis under Live Cell Conditions (2014)
  • Author(s): Takayuki Miki, Sho-hei Fujishima, Kazuhiro Komatsu, Keiko Kuwata, Shigeki Kiyonaka, Itaru Hamachi
  • Journal Title: Chemistry & Biology (Cell press) Volume: 21 Issue: 8 Pages: 1013-1022
  • DOI: 10.1016/j.chembiol.2014.07.013
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Fluorophore Labeling of Native FKBP12 by Ligand-Directed Tosyl Chemitry Allows Detection of Its Molecular Interaction in Vitro and Living Cells (2013)
  • Author(s): Tomonori Tamura, Yoshiyuki Kioi, Takayuki Miki, Shinya Tsukiji, and Hamachi Itaru
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society (ACS pubilications) Volume: 135 Issue: 18 Pages: 6782-6785
  • DOI: 10.1021/ja401956b
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] One-step Construction of Caged Carbonic Anhydrase I Using Ligand-directed Acyl Imidazole-based Protein Labeling Method (2013)
  • Author(s): Kazuya Matsuo
  • Journal Title: Chem. Sci Volume: (印刷中) Issue: 6 Pages: 2573-2580
  • DOI: 10.1039/c3sc50560j
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Zn応答性ラベル化剤を用いたconditionalプロテオミクス (2015)
  • Author(s): 三木卓幸、阿波諒、清中茂樹、浜地格
  • Organizer: 第9回バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: 熊本大学工学部 黒髪南地区キャンパス
  • Year and Date: 2015-09-10
• [Presentation] Zn応答性ラベル化剤の開発とプロテオーム解析への展開 (2015)
  • Author(s): 三木卓幸、阿波諒、浜地格
  • Organizer: 生体機能関連化学部会若手の会 第27回サマースクール
  • Place of Presentation: 神戸セミナーハウス
  • Year and Date: 2015-07-17
• [Presentation] A novel conditional protein labeling method(1):Zinc ion responsive focused proteome analysis in live cell (2015)
  • Author(s): 三木 卓幸, 阿波 諒, 清中 茂樹, 浜地 格
  • Organizer: 日本化学会第95春季年会
  • Place of Presentation: 日本大学
  • Year and Date: 2015-03-26 – 2015-03-29
• [Presentation] LDAI化学による蛋白質ラベリング(1)膜蛋白質のpulse chase解析法への展開 (2014)
  • Author(s): 三木 卓幸, 藤島 祥平, 浜地 格
  • Organizer: 日本化学会第94春季年会
  • Place of Presentation: 名古屋大学
• [Presentation] LDAI化学による内在性膜蛋白質のケミカルラベル化とpulse chase解析 (2013)
  • Author(s): 三木 卓幸, 藤島 祥平, 浜地 格
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー研究会 第8回年会
  • Place of Presentation: 東京医科歯科大学
• [Presentation] LDAIラベル化法を用いた膜蛋白質分解挙動の解析 (2013)
  • Author(s): 三木 卓幸, 藤島 祥平, 浜地 格
  • Organizer: 第25回生体機能関連化学若手の会サマースクール
  • Place of Presentation: 八王子セミナーハウス
• [Presentation] LDAI化学による内在性CAI2のmulti-color pulse chase imging (2013)
  • Author(s): 三木 卓幸, 藤島 祥平, 浜地 格
  • Organizer: 第7回バイオ関連化学合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 名古屋大学