ブタキメラ技術を基盤とした移植・再生医療に関する研究

• Project/Area Number: 13J06509
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Applied animal science
• Research Institution: Meiji University
• Principal Investigator: 中野 和明 明治大学, 農学部, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2014: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2013: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 胚盤胞補完 / クローンブタ / 異種キメラ / 遺伝子編集 / 臓器欠損 / 胚盤胞補間法 / ブタ / 体細胞核移植 / 臓器再生 / キメラ形成能

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、(1) ブタiPS細胞の多分化能（キメラ形成能）の検証、(2) 初期発生過程における異種キメラの可能性の検証、(3) 腎臓欠損ブタの作出、を主たる課題とした。
1年次には、ブタ単為発生胚を用いるキメラ胎仔作出法を開発し (Nakano et al., PLoS ONE, 2013)、ブタiPS細胞の多能性評価 (Arai et al., Genesis, 2013)を行った (課題1)。課題2に関しては、ブタ胚と異種胚細胞とによるキメラ胚の作製条件を検討した。これを受けて2年次には、異種間キメラ胎仔の作出に取り組んだ。加えて、腎臓欠損の表現型を示す、遺伝子ノックアウト (KO)ブタの作出に取り組んだ。課題2については、ブタ胚をホストとし、マウス、マーモセット胚細胞 (内部細胞塊：ICM)をドナー細胞とする、異種間キメラ胚の体内発達能と、胎仔期（体節期：胎齢20-23）におけるキメリズムについて検証した。異種間キメラ胚を借腹雌に移植し、得られた胎仔組織にドナー細胞の寄与が認められた。マウスあるいはマーモセットICMをドナー細胞とするブタ異種間キメラ胚は、体節期胎仔において、キメラ状態を維持できることを明らかとした。課題3では、ZFNを用いたゲノム編集によりSall1遺伝子をKOしたブタにおける、腎臓形成を解析した。Sall1 KO細胞を核ドナーとして作製した体細胞核移植胚から得られたクローンブタでは、腎臓形成がほぼ完全に欠落していた。さらに、痕跡的な腎組織の解析によって、Sall1遺伝子の発現消失が確認された。以上から、Sall1遺伝子をKOすることでブタにおいても腎臓欠損の表現型を誘導し得ることが明らかとなった。本研究の成果は、臓器再生の実現に向けた今後の研究に重要な基礎的知見と技術的基盤を提供すると考えられる。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Generating porcine chimeras using inner cell mass cells and parthenoge netic preimplantation embryos. (2013)
  • Author(s): Nakano K, Watanabe M, Matsunari H, Matsuda T, Honda K, Maehara M, Kanai T, Hayashida G, Kobayashi M, Kuramoto M , Arai Y, Umeyama K, Fujishiro S, Mizukami Y, Nagaya M, Ha nazono Y, Nagashima H
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 8 Issue: 4 Pages: e61900-e61900
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0061900
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Generation of interleukin-2 receptor gamma gene knockout pigs from so matic cells genetically modified by zinc finger nuclease-encoding mRNA. (2013)
  • Author(s): Watanabe M, Nakano K, Matsunari H, Matsuda T, Maehara M, Kanai T, Kobayashi M, Matsumura Y, Sakai R, Kuramoto M, Hayashida G, Asano Y, Takayanagi S, Arai Y, Umeyama K., Nagaya M, Hanazono Y, Nagashima H
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 8 Issue: 10 Pages: e76478-e76478
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0076478
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] DNA methylation profiles provide a viable index for porcine pluripotent stem cells. (2013)
  • Author(s): Arai Y, Ohgane J, Fujishiro S. Nakano K, Matsunari H, Watanabe M, Umeyama K, Azuma D, Uchida N, Sakamoto N, Makino T, Yagi S, Shiota K, Hanazono Y, Nagashima H
  • Journal Title: Genesis Volume: 51 Pages: 763-776
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Production efficiency of gene knockout pigs using genome editing and somatic cell cloning. (2015)
  • Author(s): Matsunari H, Watanabe M, Nakano K, Uchikura A, Asano Y, Hatae S, Takeishi T, Umeyama K, Nagaya M, Miyagawa S, Hanazono Y, Nakauchi H, Nagashima H
  • Organizer: 41th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • Place of Presentation: France
  • Year and Date: 2015-01-10 – 2015-01-13
• [Presentation] 中空糸法によるブタ透明除去胚および分離割球のガラス化保存 (2014)
  • Author(s): 内倉鮎子, 中野和明, 松成ひとみ, 畑江将太, 松村幸奈, 浅野吉則, 長嶋比呂志
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 帯広
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] ゲノム編集と体細胞クローニングによる免疫不全ブタの作出 (2014)
  • Author(s): 中野和明, 渡邊將人, 松成ひとみ, 小林美里奈, 松村幸奈, 坂井理恵子, 倉本桃子, 林田豪太, 浅野吉則, 内倉鮎子, 梅山一大, 長屋昌樹, 花園豊, 長嶋比呂志
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 帯広
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] In vivo exogenic organ generation with organogenesis-disabled cloned pigs as a platform (2014)
  • Author(s): Matsunari H, Nakano K, Kanai T, Matsuda T, Maehara M, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nakauchi H, Nagashima H
  • Organizer: 40th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • Place of Presentation: Reno, USA
• [Presentation] Practical application of the hollow fiber vitrification method for cryopres ervation of mammalian embryos (2014)
  • Author(s): Uchikura A, Wakayama T, Wakayama S, Matsunari H, Maehara M, Matsumura Y, Nakano K, Sasaki E, Okahara J, Tsuchiya H, Nakauchi H, Nagashima H
  • Organizer: 40th Annual Conference of the International Embryo Transfer Society
  • Place of Presentation: Reno, USA
• [Presentation] Application of blastocyst complementation to development of genetically modified pigs for xenotransplantation (2013)
  • Author(s): Nakano K, Matsunari H, Matsuda T, Kanai T, Hayashida G, Matsumura K, Kobayashi M, Kuramoto M, Asano Y, Sakai R, Uchikura A, Arai Y, Watanabe M, Umeyama K, Nagaya M, Nagashima H
  • Organizer: 12th Congress of International Xenotransplantation Association (IXA)
  • Place of Presentation: Osaka
  • Year and Date: 2013-11-13