無細胞翻訳系を用いたＳｅｃＹＥＧトランスロコンの機能発現メカニズムの解析

• Project/Area Number: 13J06852
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Structural biochemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 松林 英明 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000); Fiscal Year 2015: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2014: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2013: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 無細胞翻訳系 / PURE system / SecYEG / タンパク質膜透過 / liposome / GUV / 1分子観察 / 全反射顕微鏡 / MPIase / YidC / LepB / SecDF / 膜透過反応の蛍光測定 / 無細胞翻訳系 PURE system / Liposome / SecYEGトランスロコン / 脂質 / 膜タンパク質複合体 / タンパク質膜挿入

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに、無細胞翻訳系によるSecYEGの再構築と、それに基づいて合成する膜タンパク質のliposome膜上でのトポロジー制御について成果をまとめ、論文発表と複数の学会での発表をすることができた。本年度は、さらに研究を発展させるべく、SecYEGの無細胞合成に必要な脂質組成の解析と、合成したSecYEGの１分子観察を行った。
脂質組成の解析について、昨年度までは脂質抽出物を用いた場合でしかSecYEGの活性がみられていなかったが、脂質の脂肪酸の条件検討により合成脂質で再構成することに成功した。脂質抽出物はGiant Unilamellar Vesicle (GUV)の作成などに適さなかったため、今回得られた結果により、人工細胞システムや膜タンパク質の試験管内進化への幅広い応用が期待できる。また、昨年度に見出された糖脂質様の分子について、微量な分子なために解析が難しかったが、岩手大学西山研究室との共同研究先で引き続き解析を行って頂いている。
SecYEGの膜透過活性について、基質の分泌タンパク質であるpOmpAのアミノ酸長を短くした場合に、再構成系においても膜透過のターンオーバーが検出された。詳細な速度論の解析を行うため東京大学野地研究室との共同研究で１分子観察に取り組んだ。まず、無細胞系によるSecY、SecEの蛍光標識と人工脂質平面膜上への再構成の条件を確立し、全反射顕微鏡によって観察したところ、SecYやSecEのサブユニットが単独で存在する場合も、純粋な脂質膜上では安定的に拡散することが初めて明らかになった。また、膜透過反応を観察するためpOmpAを蛍光標識して１分子観察を行ったが、脂質膜への非特異的な結合が見られた。条件検討を行ったものの、顕微鏡上に再構成する平面膜の不安定性もあり膜透過反応を解析するには至らなかったが、精製と再構成の煩雑さから１分子観察系の例が少ない膜タンパク質について、無細胞翻訳系の有用性を示す結果を得た。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] In Vitro Synthesis of the E. coli Sec Translocon from DNA. (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda.
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition. Volume: 53 Issue: 29 Pages: 7535-7538
  • DOI: 10.1002/anie.201403929
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Purified cell-free system as standard parts for synthetic biology. Current Opinion In Chemical Biology. (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Takuya Ueda.
  • Journal Title: Current Opinion In Chemical Biology. Volume: 22 Pages: 158-162
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2014.09.031
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell-Free Synthesis of SecYEG Translocon as the Fundamental Protein Transport Machinery (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda.
  • Journal Title: Origins of Life and Evolution of Biospheres. Volume: 44 Issue: 4 Pages: 331-334
  • DOI: 10.1007/s11084-014-9389-y
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 無細胞タンパク質合成系 (2014)
  • Author(s): 松林英明，上田卓也
  • Journal Title: 高分子学会誌「高分子」 Volume: 63 Pages: 379-381
• [Presentation] 無細胞翻訳系によるSecYEGトランスロコンの合成と解析 (2016)
  • Author(s): 松林英明
  • Organizer: 生化学若い研究者の会 関東支部 Biological Science Graduate Seminar
  • Place of Presentation: 御茶ノ水女子大学本館103会議室
  • Year and Date: 2016-03-20
  • Invited
• [Presentation] In Vitro Synthesis of SecYEG Translocon (2016)
  • Author(s): 松林英明
  • Organizer: ソフトマター若手勉強会
  • Place of Presentation: 東京大学検見川セミナーハウス
  • Year and Date: 2016-03-10
• [Presentation] Cell-free synthesis of Sec translocon on liposome membrane (2015)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda.
  • Organizer: Biophysical Society 59th Annual Meeting. Baltimore
  • Place of Presentation: Baltimore Convention Center, Baltimore, Maryland, USA
  • Year and Date: 2015-02-07 – 2015-02-11
• [Presentation] 無細胞翻訳系によるSecYEGトランスロコンの合成 (2014)
  • Author(s): 松林 英明、車 兪澈、上田 卓也
  • Organizer: 第37回 日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県、横浜市、パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2014-11-25 – 2014-11-27
• [Presentation] 無細胞翻訳系による SecYEG トランスロコンの合成 (2014)
  • Author(s): 松林 英明、車 兪澈、上田 卓也
  • Organizer: 第52回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 北海道、札幌市、札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2014-09-25 – 2014-09-27
• [Presentation] In Vitro Synthesis of Sec Translocon from DNA (2014)
  • Author(s): Hideaki Matsubayashi, Yutetsu Kuruma, Takuya Ueda.
  • Organizer: Open Questions on the Origin of Life 2014
  • Place of Presentation: 京都府、木津川市、国際高等研究所
  • Year and Date: 2014-07-12 – 2014-07-13
• [Presentation] 膜タンパク質合成システム-Secトランスロコン-を創る (2013)
  • Author(s): 松林英明
  • Organizer: 「細胞を創る」研究会6.0
  • Place of Presentation: 鶴岡慶應義塾大学鶴岡タウンキャンパス
  • Year and Date: 2013-11-14
• [Presentation] 無細胞タンパク質合成系を用いたSecYEGトランスロコンの構築 (2013)
  • Author(s): 松林英明
  • Organizer: 第8回無細胞生命科学研究会
  • Place of Presentation: 新潟新潟大学
  • Year and Date: 2013-10-21
• [Presentation] In vitro synthesis of Membrane Protein Machinery toward the Construction of Artificial Cell (2013)
  • Author(s): 車ゆうてつ
  • Organizer: 12th European Conference on Artificial Life (ECAL 2013)
  • Place of Presentation: タオルミナ(イタリア)
  • Year and Date: 2013-09-03
• [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩（東京大学 新領域創成科学研究科 ニュース）
  • URL: http://www.k.u-tokyo.ac.jp/info/entry/22_entry315/
• [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩（東工大ニュース）
  • URL: http://www.titech.ac.jp/news/2014/028029.html
• [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩
  • URL: http://www.k.u-tokyo.ac.jp/info/entry/22_entry315/
• [Remarks] 機能性細胞膜の合成に成功、人工細胞にむけて大きな一歩
  • URL: http://old.elsi.jp/ja/press_release/0623/
• [Remarks] 上田卓也研究室ホームページ
  • URL: http://park.itc.u_tokyo.ac.jp/molbio/