テンプレートによるタンパク質結晶の核形成の促進とマイクロ流体デバイスへの応用

• Project/Area Number: 13J07016
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Microdevices/Nanodevices
• Research Institution: Hokkaido University (2014); Kyushu University (2013)
• Principal Investigator: 真栄城 正寿 北海道大学, 工学研究院, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2014: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2013: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: マイクロ流体デバイス / タンパク質 / 結晶化 / 脂質二重膜 / マクロ流体デバイス

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、基板上に形成させたテンプレートによるタンパク質結晶の核形成促進を目的として、昨年度設計した試作型デバイスを用いて、脂質二重膜をテンプレートにしたタンパク質の結晶化に着手した。さらに、その結果を基にしてマイクロ流体デバイスへの応用を試みた。
試作型デバイスは、金薄膜を蒸着したガラス基板上にリソグラフィー技術によってSU-8製のマイクロウェルを作製した。マイクロウェル上に脂質二重膜を形成させ、その上にHisタグ付きタンパク質を固定化してテンプレートを作製した。結晶化に最適なテンプレートを作製するために、溶液濃度や脂質二重膜の条件、固定化時間などを検討した。Hisタグ付きGFPをモデルタンパク質として結晶化実験を行った。脂質の種類、脂質の混合比について検討を行った結果、Hisタグ付きGFPを固定するための脂質濃度が高くなるにつれて、GFPの結晶が析出しにくくなることが分かった。一方で、脂質の混合比を調整して、hisタグ付きタンパク質の濃度を低下させると、液滴中に多数の結晶の析出が観測された。これらの結果から、テンプレートであるHisタグ付きタンパク質の固定化密度が結晶化挙動に影響を与えていることが示唆された。
次に、本年度の目標であるマイクロ流体デバイスへの応用を行った。マイクロデバイスでは、1条件あたりに必要な結晶化溶液の体積は約30 nLであり、試作型と比較すると30~40分の1程度のサンプル量で結晶化が可能であった。また、単位体積あたりの結晶数を従来法や試作型デバイスと比較すると、析出した結晶数が劇的に増加することが明らかとなった。これらの結果から、マイクロ流体デバイスと脂質二重膜-Hisタグ付きタンパク質を用いた結晶化手法は、タンパク質の核形成を促進させる可能性が見出された。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Microreactor Extraction System with Macrocyclic Host Compounds for Rare Metal Recovery (2014)
  • Author(s): Keisuke Ohto, Jee Young Kim, Shintaro Morisada, Masatoshi Maeki, Kenichi Yamashita, Masaya Miyazaki
  • Journal Title: International Journal of the Society of Materials Engineering for Resources Volume: 20 Pages: 92-96
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal Habit Modification of Protein by Using Microfluidic chip (2014)
  • Author(s): Masatoshi Maeki, Ashtamurthy Pawate, Keiichi Watanabe, Manabu Tokeshi, Paul J. A. Kenis, Masaya Miyazaki
  • Journal Title: Proceeding of the 18th International Conference on. Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences Volume: - Pages: 1083-1085
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] A Method of Effective Cryoprotection for X-ray Analysis of Protein Crystal (2014)
  • Author(s): Masatoshi Maeki, Ashtamurthy S. Pawate, Kenichi Yamashita, Masahide Kawamoto, Keiichi Watanabe, Manabu Tokeshi, Paul J. A. Kenis, Masaya Miyazaki
  • Journal Title: Proceedings of the 6th International Symposium on Microchemistry and Microsystems Volume: - Pages: 224-225
• [Journal Article] Controlling Protein Crystal Nucleation by Droplet-based Microfluidics (2014)
  • Author(s): Masatoshi Maeki, Yuki Teshima, Saori Yoshizuka, Hiroshi Yamaguchi, Kenichi Yamashita, Masaya Miyazaki
  • Journal Title: A Chemistry European Journal Volume: 20 Issue: 4 Pages: 1049-1056
  • DOI: 10.1002/chem.201490013
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Controlling One Protein Crystal Growth by Droplet-based Microfluidics System (2013)
  • Author(s): Hiroshi Yamaguchi, Masatoshi Maeki, Kenichi Yamashita, Hiroyuki Nakamura, Masaya Miyazaki, Hideaki Maeda
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 153 Issue: 4 Pages: 339-346
  • DOI: 10.1093/jb/mvt001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] マイクロ流体技術のタンパク質化学への応用 (2013)
  • Author(s): 真栄城 正寿
  • Journal Title: 化学とマイクロ・ナノシステム研究会誌 Volume: 12 Pages: 19-22
  • Peer Reviewed
• [Presentation] マイクロ流体デバイスによるタンパク質の結晶化制御技術 (2014)
  • Author(s): 真栄城正寿，Ashtamurthy S. Pawate, 渡邉啓一, 渡慶次学, Paul J. A. Kenis, 宮崎真佐也
  • Organizer: 平成26年度日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 東京大学（東京都、文京区本郷）
  • Year and Date: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [Presentation] Crystal Habit Modification of Protein by Using Microfluidic chip (2014)
  • Author(s): Masatoshi Maeki, Ashtamurthy Pawate, Keiichi Watanabe, Manabu Tokeshi, Paul J. A. Kenis, Masaya Miyazaki
  • Organizer: The 18th International Conference on. Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Micro Tas 2014)
  • Place of Presentation: San Antonio, TX, （USA）
  • Year and Date: 2014-10-26 – 2014-10-30
• [Presentation] A Method of Effective Cryoprotection for X-ray Analysis of Protein Crystal (2014)
  • Author(s): Masatoshi Maeki, Ashtamurthy S. Pawate, Kenichi Yamashita, Masahide Kawamoto, Keiichi Watanabe, Manabu Tokeshi, Paul J. A. Kenis, Masaya Miyazaki
  • Organizer: The 6th International Symposium on Microchemistry and Microsystems (ISMM2014)
  • Place of Presentation: Singapore（Singapore）
  • Year and Date: 2014-07-30 – 2014-08-01
• [Presentation] マイクロ流路を用いたタンパク質の晶癖制御 (2014)
  • Author(s): 真栄城正寿、Ashtamurthy Pawate、渡邉啓一、 渡慶次学、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也
  • Organizer: 化学とマイクロ・ナノシステム学会 第29回研究会
  • Place of Presentation: 日本女子大学（東京都、文京区目白台）
  • Year and Date: 2014-05-22 – 2014-05-23
• [Presentation] タンパク質結晶のOn-chip段階的抗凍結処理法 (2014)
  • Author(s): 真栄城正寿・山下健一・河本正秀・渡邉啓一・宮崎真佐也
  • Organizer: 平成26年度日本生化学会 九州支部例会
  • Place of Presentation: 九州大学（福岡県、福岡市）
  • Year and Date: 2014-05-17 – 2014-05-18
• [Presentation] マイクロ流体デバイスを用いたタンパク質結晶のシーディング (2013)
  • Author(s): 真栄城正寿、湧川盛洋、Ashtamurthy Pawate、山下健一、渡邉啓一、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也
  • Organizer: 化学とマイクロ・ナノシステム学会 第27回研究会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県仙台市)
• [Presentation] マイクロ流体技術のタンパク質化学への応用 (2013)
  • Author(s): 真栄城正寿
  • Organizer: 化学とマイクロ・ナノシステム学会 第27回研究会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県仙台市)
  • Invited
• [Presentation] マイクロ流体デバイスを用いた好冷細菌Pseudoalterommonas sp. AS-131由来グルコキナーゼ結晶のシーディング (2013)
  • Author(s): 真栄城正寿、湧川盛洋、Ashtamurthy Pawate、山下健一、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也、渡邉啓一
  • Organizer: 平成25年度日本生化学会九州支部例会
  • Place of Presentation: 佐賀大学(佐賀県佐賀市)
• [Presentation] マイクロ空間を用いる晶析制御 (2013)
  • Author(s): 真栄城正寿
  • Organizer: マイクロ化学プロセス分科会 第4回討論・交流会
  • Place of Presentation: 産業技術総合研究所九州センター(佐賀県鳥栖市)
  • Invited
• [Presentation] Crystallization of Glucokinase from Psychrophilic Pseudoalteromonas sp. AS-131 in Microfluidic Chip and Its Application for On-chip X-ray Diffraction (2013)
  • Author(s): Masaya Miyazaki, Masatoshi Maeki, Ashtamurthy S. Pawate, Morihiro Wakugawa, Kenichi Yamashita, Keiichi Watanabe, Paul J. A. Kenis
  • Organizer: RSC Tokyo International Conference 2013
  • Place of Presentation: 幕張メッセ(千葉県千葉市)
• [Presentation] マイクロ流体デバイスとミクロシーディング法による好冷細菌Pseudoalteromonas sp. AS-131由来グルコキナーゼの結晶化の制御 (2013)
  • Author(s): 真栄城正寿、湧川盛洋、Ashtamurthy Pawate、河本正秀、山下健一、Paul J. A. Kenis、渡邊啓一、宮崎真佐也
  • Organizer: 第86回 日本生化学会大会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
• [Presentation] On-chipでのタンパク質結晶の段階的抗凍結処理と回折強度への影響 (2013)
  • Author(s): 真栄城正寿、Ashtamurthy Pawate、山下健一、河本正秀、渡邉啓一、Paul J. A. Kenis、宮崎真佐也
  • Organizer: 化学とマイクロ・ナノシステム学会 第28回研究会
  • Place of Presentation: イーグレ姫路(兵庫県姫路市)