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糖鎖プロセシング酵素と相同性を有する酵素の立体構造解析に基づく新規オリゴ糖の創出

Research Project

Project/Area Number 13J07279
Research Category

Grant-in-Aid for JSPS Fellows

Allocation TypeSingle-year Grants
Section国内
Research Field Applied biochemistry
Research InstitutionTokyo University of Agriculture and Technology

Principal Investigator

宮崎 剛亜  東京農工大学, 大学院農学研究院, 特別研究員(PD)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2014)
Budget Amount *help
¥2,070,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2014: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2013: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
KeywordsN結合型糖鎖 / 糖質加水分解酵素 / オリゴ糖 / X線結晶構造解析 / グライコシンターゼ / フッ化糖 / グルコシダーゼ / ガラクトシダーゼ
Outline of Annual Research Achievements

本研究は、真核生物の有するN結合型糖鎖プロセシング酵素およびそれと相同性を有する細菌由来機能未知酵素を対象とし、X線結晶構造解析に基づく反応機構の解明および基質特異性に関わるアミノ酸残基の特定、さらにグライコシンターゼ化による有用なオリゴ糖および糖鎖合成酵素を作出することを目的とした。前年度より引き続き、プロセシングα-グルコシダーゼⅠが属する糖質加水分解酵素ファミリー63(GH63)、そしてプロセシングα-グルコシダーゼⅡが属するファミリー31(GH31)の酵素について研究を行い、主に以下の成果を得た。
1. 大腸菌由来GH63酵素YgjKは前年度までに二糖2-O-α-グルコシルガラクトースを生成する2種類のグライコシンターゼ変異体(D324NおよびE727A)を得ている。前年度に行った二糖との複合体構造解析に基づき新たな変異体を構築し、糖の合成能を比較した。その結果、GH63酵素の活性部位近傍に保存されているチロシン残基をフェニルアラニンに置換した変異体のオリゴ糖合成能が最も高いことがわかった。
2. 近年グルコシル-/マンノシル-グリセリン酸加水分解酵素と同定された好熱菌由来GH63酵素(Tt8MGH)のX線結晶構造解析を行った。Tt8MGHのアポ構造、生成物であるグルコースまたはグリセリン酸との複合体構造を1.67-2.10 Å分解能で決定し、Tt8MGHに特徴的な3つのループが基質認識に関与していることがわかった。
3. 細菌由来GH31機能未知酵素(PsGal31A)の大腸菌発現系の構築、組換え酵素の性質解析を行ったところ、GH31として初めてα-ガラクトシダーゼ活性を示す酵素であることがわかった。また、X線結晶構造解析によりPsGal31Aの立体構造を明らかにし、本酵素のユニークな基質特異性に関する知見を得た。
以上の成果により、GH31およびGH63に属するユニークな基質特異性を有する加水分解酵素を新規なオリゴ糖合成酵素に変換するための基盤を確立した。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2014 Annual Research Report
  • 2013 Annual Research Report
  • Research Products

    (18 results)

All 2015 2014 2013

All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results,  Acknowledgement Compliant: 3 results) Presentation (11 results)

  • [Journal Article] The side chain of a glycosylated asparagine residue is important for the stability of isopullulanase.2015

    • Author(s)
      Takatsugu Miyazaki, Hiroyuki Yashiro, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
    • Journal Title

      Journal of Biochemistry

      Volume: 157 Issue: 4 Pages: 225-234

    • DOI

      10.1093/jb/mvu065

    • Related Report
      2014 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Crystal structure and substrate-binding mode of GH63 mannosylglycerate hydrolase from Thermus thermophilus HB8.2015

    • Author(s)
      Takatsugu Miyazaki, Megumi Ichikawa, Hitoshi Iino, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
    • Journal Title

      Journal of Structural Biology

      Volume: 190 Issue: 1 Pages: 21-30

    • DOI

      10.1016/j.jsb.2015.02.006

    • Related Report
      2014 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Structural and biochemical characterization of novel bacterial α-galactosidases belonging to glycoside hydrolase family 312015

    • Author(s)
      Takatsugu Miyazaki, Yuichi Ishizaki, Megumi Ichikawa, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
    • Journal Title

      Biochemical Journal

      Volume: in press Issue: 1 Pages: 145-158

    • DOI

      10.1042/bj20150261

    • Related Report
      2014 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] Enhancing thermostability and the structural characterization of Microbacterium saccharophilum K-1 β-fructofuranosidase.2014

    • Author(s)
      Yukari Ohta, Yuji Hatada, Yuko Hidaka, Yasuhiro Shimane, Keiko Usui, Tetsuya Ito, Koki Fujita, Gaku Yokoi, Marina Mori, Shona Sato, Takatsugu Miyazaki, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
    • Journal Title

      Applied Microbiology and Biotechnology

      Volume: (in press) Issue: 15 Pages: 6667-6677

    • DOI

      10.1007/s00253-014-5645-3

    • Related Report
      2013 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] GH63に属するグルコシダーゼの構造と基質特異性に関する新しい知見2013

    • Author(s)
      宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Journal Title

      応用糖質科学

      Volume: 第3巻 Pages: 151-158

    • NAID

      220000139116

    • Related Report
      2013 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Crystal structure of a glycoside hydrolase family 131 protein from Coprinopsis cinerea.2013

    • Author(s)
      Takatsugu Miyazaki, Makoto Yoshida, Mizuki Tamura, Yutaro Tanaka, Kiwamu Umezawa, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
    • Journal Title

      FEBS Letters

      Volume: 587 Issue: 14 Pages: 2193-2198

    • DOI

      10.1016/j.febslet.2013.05.041

    • Related Report
      2013 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structure of a bacterial glycoside hydrolase family 63 enzyme in complex with its glycosynthase product, and insights into the substrate specificity.2013

    • Author(s)
      Takatsugu Miyazaki, Megumi Ichikawa, Gaku Yokoi, Motomitsu Kitaoka, Haruhide Mori, Yoshikazu Kitano, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
    • Journal Title

      FEBS Journal

      Volume: 280 Issue: 18 Pages: 4560-4571

    • DOI

      10.1111/febs.12424

    • Related Report
      2013 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Pedobacter saltans 由来GH31 α-ガラクトシダーゼとリガンドとの複合体構造解析2015

    • Author(s)
      宮崎 剛亜, 石嵜 雄一, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本農芸化学会2015年度大会
    • Place of Presentation
      岡山大学津島キャンパス(岡山市)
    • Year and Date
      2015-03-28
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] タンパク質の安定性におけるN結合型糖鎖が付加したアスパラギン残基の役割の解析2015

    • Author(s)
      宮崎 剛亜, 矢代 浩之, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本農芸化学会2015年度大会
    • Place of Presentation
      岡山大学津島キャンパス(岡山市)
    • Year and Date
      2015-03-27
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] α-ガラクトシダーゼ活性を示す新奇な細菌由来GH31グリコシダーゼのX線結晶構造解析2014

    • Author(s)
      宮崎 剛亜, 市川 めぐみ, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本応用糖質科学会平成26年度大会
    • Place of Presentation
      朱鷺メッセ 新潟コンベンションセンター(新潟市)
    • Year and Date
      2014-09-24 – 2014-09-25
    • Related Report
      2014 Annual Research Report
  • [Presentation] Arthrobacter globiformis T-6由来イソマルトデキストラナーゼとパノースとの複合体の立体構造解析2014

    • Author(s)
      岡沢 唯香, 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本農芸化学会2014年度大会
    • Place of Presentation
      明治大学生田キャンパス(神奈川県川崎市)
    • Year and Date
      2014-03-28
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Microbacterium saccharophilum K-1由来β-フルクトフラノシダーゼ耐熱化酵素の立体構造解析2014

    • Author(s)
      盛 まりな, 横井 岳, 佐藤 祥名, 宮崎 剛亜, 大田 ゆかり, 嶋根 康弘, 秦田 勇二, 藤田 孝輝, 伊藤 哲也, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本農芸化学会2014年度大会
    • Place of Presentation
      明治大学生田キャンパス(神奈川県川崎市)
    • Year and Date
      2014-03-28
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Arthrobacter globiformis T-6由来イソマルトデキストラナーゼの糖結合モジュールCBM35の構造解析2014

    • Author(s)
      岡沢 唯香, 横井 岳, 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      物構研サイエンスフェスタ2013
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場(茨城県つくば市)
    • Year and Date
      2014-03-18
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Microbacterium saccharophilum由来β-フルクトフラノシダーゼ全長の構造解析2014

    • Author(s)
      盛 まりな, 横井 岳, 佐藤 祥名, 宮崎 剛亜, 伊藤 哲也, 藤田 孝輝, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      物構研サイエンスフェスタ2013
    • Place of Presentation
      つくば国際会議場(茨城県つくば市)
    • Year and Date
      2014-03-18
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] 担子菌Coprinopsis cinerea由来GH131タンパク質N末端ドメインのX線結晶構造解析2013

    • Author(s)
      宮崎 剛亜, 田村 瑞, 田中 祐太郎, 梅澤 究, 吉田 誠, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本応用糖質科学会平成25年度大会
    • Place of Presentation
      鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2013-09-25
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Arthrobacter globtformis T-6由来イソマルトデキストラナーゼのX線結晶構造解析2013

    • Author(s)
      岡沢 唯香, 横井 岳, 宮崎 剛亜, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      日本応用糖質科学会平成25年度大会
    • Place of Presentation
      鹿児島大学郡元キャンパス(鹿児島県鹿児島市)
    • Year and Date
      2013-09-25
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Conformational changes and substrate recognition of an uncharacterized glycosidase YgjK belonging to GH63 from Escherichia coil.2013

    • Author(s)
      Takatsugu Miyazaki, Megumi Ichikawa, Haruhide Mori, Motomitsu Kitaoka, Yoshikazu Kitano, Atsushi Nishikawa and Tonozuka Tonozuka.
    • Organizer
      10th Carbohydrate Bioengineering Meeting
    • Place of Presentation
      Prague, Czech Republic
    • Related Report
      2013 Annual Research Report
  • [Presentation] Thermus Thermophilus HB8由来グルコシル/マンノシルグリセリン酸分解酵素とリガンドとの複合体の構造解析2013

    • Author(s)
      市川 めぐみ, 宮崎 剛亜, 吉田 裕美, 神鳥 成弘, 西河 淳, 殿塚 隆史
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      パシフィコ横浜(神奈川県横浜市)
    • Related Report
      2013 Annual Research Report

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Published: 2014-01-29   Modified: 2024-03-26  

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