タンパク質膜組み込み機構の構造基盤の解明

• Project/Area Number: 13J08353
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 熊崎 薫 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥2,700,000 (Direct Cost: ¥2,700,000); Fiscal Year 2015: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2014: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2013: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: タンパク質膜組み込み / YidC / X線結晶構造解析 / Ｘ線結晶構造解析 / ＹｉｄＣ

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、タンパク質膜組み込み機構の構造基盤の解明のため、YidCの立体構造情報に基づいた機能解析を進めることを目指している。前年度までの研究から、YidCが分子内部に親水的なアミノ酸残基を多く含んだ溝をもち、その溝を介して基質タンパク質と相互作用することが明らかとなった。しかし、YidCの基質認識機構や、タンパク質膜組み込み機構のダイナミクスは不明のままであった。そこで本年度は、YidCとその基質タンパク質との複合体のX線結晶構造解析を行い、それらを明らかにすることを目指した。
YidCのC末端に基質タンパク質を融合させ、YidC-基質タンパク質の融合タンパク質として構造解析を行うことを試みた。アフィニティの低い二つのタンパク質の複合体の構造解析を行う際に、両者をリンカーを介して融合し、両者が相互作用しやすくするという手法は、有効な戦略の一つである（Kang et al., Nature, 2015）。基質タンパク質を融合させた際のトポロジーを考慮し、適したトポロジーをもつMscLを基質タンパク質として使用した。
YidC-MscLの融合タンパク質を大腸菌に過剰発現させ、界面活性剤ドデシルマルトシドにより可溶化し、Niアフィニティークロマトグラフィー、プロテアーゼによるHisタグの切断、ゲルろ過クロマトグラフィーという過程により精製した。精製タンパク質に対し、脂質キュービック相法による結晶化スクリーニングを行ったところ、結晶が得られ、大型放射光施設SPring-8にてX線回折実験を行ったところ、最大分解能7.0Åの回折データを得ることができた。しかし、得られた分解能のデータでの構造解析は非常に困難であり、得られたモデルの構造精密化を十分に行うことはできなかった。現在は、さらに高分解能のデータ取得を目指し、結晶化コンストラクトの最適化や結晶化条件の最適化を行っている。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] 7.Crystal Structures of SecYEG in Lipidic Cubic Phase Elucidate a Precise Resting and a Peptide-Bound State (2015)
  • Author(s): Yoshiki Tanaka, Yasunori Sugano, Mizuki Takemoto, Takaharu Mori, Arata Furukawa, Tsukasa Kusakizako, Kaoru Kumazaki, Ayako Kashima, Ryuichiro Ishitani, Yuji Sugita, Osamu Nureki, Tomoya Tsukazaki
  • Journal Title: Cell report Volume: 13 Issue: 8 Pages: 1561-1568
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2015.10.025
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Hydrophilic microenvironment required for the channel-independent insertase function of YidC protein. (2015)
  • Author(s): Shimokawa-Chiba, N., Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nureki, O., Ito, K. and Chiba, S.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Volume: 112 Issue: 16 Pages: 5063-5068
  • DOI: 10.1073/pnas.1423817112
  • NAID: 120005716850
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Structural basis for Sec-independent membrane protein insertion by YidC. (2014)
  • Author(s): Kumazaki, K., Chiba, S., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito K., Ishitani, R., Tsukazaki, T. and Nureki, O.
  • Journal Title: Nature Volume: 509 Issue: 7501 Pages: 516-520
  • DOI: 10.1038/nature13167
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase (2014)
  • Author(s): Kumazaki, K., Kishimoto, T., Furukawa, A., Mori, H., Tanaka, Y., Dohmae, N., Ishitani, R., Tsukazaki, T., and Nureki, O.
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 4 Issue: 1 Pages: 7299-7299
  • DOI: 10.1038/srep07299
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans. (2014)
  • Author(s): Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nishizawa, T., Tanaka, Y., Kato, H.E., Nakada-Nakura, Y., Hirata, K., Mori, Y., Suga, H., Dohmae, N., Ishitani, R. and Nureki, O.
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications Volume: 70 Issue: 8 Pages: 1056-1060
  • DOI: 10.1107/s2053230x14012540
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] タンパク質膜組み込みに関わる膜タンパク質YidCのX線結晶構造解析 (2014)
  • Author(s): 熊崎 薫, 千葉 志信, 武本 瑞貴, 古川 新, 伊藤 維昭, 石谷 隆一郎, 塚崎 智也, 濡木 理
  • Organizer: 日本結晶学会 平成26年度年会
  • Place of Presentation: 東京大学農学部 (東京都, 文京区)
  • Year and Date: 2014-11-01 – 2014-11-03
• [Presentation] タンパク質膜組み込みに関わる膜タンパク質YidCのX線結晶構造解析 (2014)
  • Author(s): 熊崎 薫
  • Organizer: 日本蛋白質科学会
  • Place of Presentation: ワークピア横浜 (神奈川県, 横浜市)
  • Year and Date: 2014-06-26 – 2014-06-28
  • Invited
• [Presentation] Structural basis of Sec-independent membrane protein insertion by YidC (2014)
  • Author(s): 熊崎 薫, 千葉 志信, 石谷 隆一郎, 塚崎 智也, 濡木 理
  • Organizer: 第14回 東京大学 生命科学シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学本郷キャンパス (東京都, 文京区)
  • Year and Date: 2014-04-26 – 2014-04-28
• [Presentation] Crystal Structure of YidC and a Mechanism of Membrane Protein Insertion (2014)
  • Author(s): Kaoru Kumazaki
  • Organizer: Gordon Research Conferences : Protein Transport Across Cell Membranes
  • Place of Presentation: アメリカ・ガルベストン
  • Year and Date: 2014-03-09