毒素に対する可食性ＩｇＡ植物抗体の防御効果に関する研究

• Project/Area Number: 13J10915
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Hygiene
• Research Institution: University of Shizuoka
• Principal Investigator: 中西 勝宏 静岡県立大学, 薬学研究院, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2014)
• Budget Amount: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2014: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2013: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: 分泌型IgA / Plantibody / Shiga toxin

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、腸管のような粘膜組織で主要な防御機能を果たす分泌型IgA抗体を発現し、経口摂取によりShiga toxin 1 (Stx1、赤痢菌や腸管出血性大腸菌の産生する毒素) による食中毒を治療できる遺伝子組換え植物を作製することを目的としている。今年度は、「①分泌型IgA発現植物の治療効果の検証を目指した動物実験モデルの構築」、「②IgA植物抗体の精製法の確立」、「③継代による植物抗体の発現量変化の解析」について実験を行い、以下に記す結果を得た。
①Stx1による大腸の傷害を誘導するため、Stx1ホロトキシンをマウスへ直腸投与した。活性化カスパーゼ3に対する抗体を用いて大腸の免疫組織染色を行い、Stx1による大腸上皮細胞のアポトーシスを検出した。また、Stx1に特異的なマウス二量体IgAを経口投与し、継時的に回収した糞中のStx1特異的IgA抗体価を測定したところ、経口投与５時間後に最大となった。これらの結果から、Stx1による大腸障害の動物実験モデルを構築でき、植物抗体の最適な経口投与時間が明らかになったため、生体を用いた植物抗体の治療効果の実証実験が可能となった。
②作製した抗体発現植物のタンパク質抽出液から植物由来の夾雑物や抗体の分解物といった植物抗体の性状解析を妨害する物質を除くため、チオール親和性クロマトグラフィーによる植物抗体の精製を試みた。精製により不完全な抗体が減少、総タンパク質に占めるIgAの割合の増加が見られ、本精製法が有用であることが分かった。
③作製した分泌型IgA発現植物（T1）の自家交配で得られたT2 から、薬剤耐性を基準にホモ接合体を選抜し、以下ホモ接合体同士の自家交配をT4まで行なった。T2 (ホモ接合体の第一世代) とT4 (ホモ接合体の第三世代) からIgAを抽出し、ELISAでIgA発現量を比較した結果、両者に差はなく世代を経ても安定的にIgAを発現できることが明らかになった。

Research Progress Status

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

26年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Shiga toxin-induced apoptosis is more efficiently inhibited by dimeric recombinant hybrid-IgG/IgA immunoglobulins than by the parental IgG monoclonal antibodies (2014)
  • Author(s): Kurohane K, Nagano K, Nakanishi K, Iwata K, Miyake M, Imai Y
  • Journal Title: Virulence Volume: 5 Issue: 8 Pages: 819-824
  • DOI: 10.4161/21505594.2014.973804
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Stable Expression and Characterization of Monomeric and Dimeric Recombinant Hybrid-IgG/IgA Immunoglobulins Specific for Shiga Toxin (2014)
  • Author(s): Iwata K, Kurohane K, Nakanishi K, Miyake M, Imai Y
  • Journal Title: Biological and Pharmaceutical Bulletin Volume: 37 Issue: 9 Pages: 1510-1515
  • DOI: 10.1248/bpb.b14-00323
  • NAID: 130004147362
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Plantibodyの臨床応用 (2014)
  • Author(s): 中西勝宏、黒羽子孝太、今井康之
  • Journal Title: 臨床免疫・アレルギー科 Volume: 62 Pages: 192-197
  • NAID: 40020185066
• [Journal Article] Production of Hybrid-IgG/IgA Plantibodies with Neutralizing Activity against Shiga Toxin 1 (2013)
  • Author(s): Nakanishi K, Narimatsu S, Ichikawa S, Tobisawa Y, Kurohane K, Niwa Y, Kobayashi H, Imai Y
  • Journal Title: PLoS One Volume: 8 Issue: 11 Pages: e80712-e80712
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0080712
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Separation and characterization of intact dimeric form of Shiga toxin 1-specific hybrid-IgA plantibodies expressed in Arabidopsis thaliana (2014)
  • Author(s): Tsuruta S, Nakanishi K, Kurohane K, Imai Y
  • Organizer: 第43回日本免疫学会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-12-10 – 2014-12-12
• [Presentation] Comparison of the Hybrid IgA Expressed in Plant and Mammalian Cell Systems (2014)
  • Author(s): Nakanishi K, Tsuruta S, Kurohane K, Niwa Y, Kobayashi H, Imai Y
  • Organizer: Sixth Annual Protein & Antibody Engineering Summit Europe
  • Place of Presentation: Lisbon, Portugal
  • Year and Date: 2014-11-05 – 2014-11-07
• [Presentation] Purification of dimeric hybrid-IgA expressed in plants and mammalian cells using thiophilic adsorption chromatography (2014)
  • Author(s): Tsuruta S, Nakanishi K, Kurohane K, Imai Y
  • Organizer: 第2回薬食国際カンファレンス
  • Place of Presentation: 沼津 (静岡県)
  • Year and Date: 2014-11-05 – 2014-11-06
• [Presentation] Development of neutralizing hybrid-IgG/IgA specific for Shiga toxin (2014)
  • Author(s): Kurohane K, Nakanishi K, Imai Y
  • Organizer: 11th Japan-China International Symposium on Health Science
  • Place of Presentation: 静岡
  • Year and Date: 2014-11-05 – 2014-11-06
• [Presentation] Production of secretory hybrid-IgA specific for Shiga toxin 1 in lettuce. (2013)
  • Author(s): Nakanishi K, Kurohane K, Imai Y
  • Organizer: 第42回日本免疫学会
  • Place of Presentation: 幕張
  • Year and Date: 2013-12-12
• [Presentation] 植物で作製した分泌片の糖鎖解析 (2013)
  • Author(s): 荒木瞳、中西勝宏、鶴田昌吾、黒羽子孝太、丹羽康夫、小林裕和、今井康之
  • Organizer: 日本病院薬剤師会東海ブロック日本薬学会東海支部合同学術大会
  • Place of Presentation: 三重
  • Year and Date: 2013-11-10
• [Presentation] Production of dimeric hybrid-IgA specific for Shiga toxin 1 in Arabidopsis thaliana. (2013)
  • Author(s): Nakanishi K, Kurohane K, Niwa Y, Kobayashi H, Imai Y
  • Organizer: Plant-based Vaccines, Antibodies and Biologics
  • Place of Presentation: Verona, Italy
• [Remarks] 静岡県立大学薬学部 免疫微生物学分野 ホームページ
  • URL: http://w3pharm.u-shizuoka-ken.ac.jp/bisei/
• [Remarks]
  • URL: http://w3pharm.u-shzuoka-ken.ac.jp/bisei/