高効率ＤＮＡ内シグナル伝達システムの構築とＤＮＡ光切断を用いた遺伝子操作法の開発

• Project/Area Number: 13J40062
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Research Field: Chemistry related to living body
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 田仲 真紀子 筑波大学, 生命領域学際研究センター, 特別研究員(RPD)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2015: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2014: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2013: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
• Keywords: DNA / PNA / RNase A / インベージョン / 人工核酸 / チアゾールオレンジ / 光損傷 / 8-オキソグアニン / 蛍光プローブ / 光酸化

Outline of Annual Research Achievements

本研究では人工ペプチド核酸PNAを用いた光による新たなDNA操作法の開発を目指している。人工核酸PNAは修飾核酸を用いることにより、DNA中の任意の配列をターゲットとしてDNAにインベージョン（侵入）することができる。実用性の観点からは単一のPNA鎖のインベージョンがより汎用性があるが、これまでのところ単一PNA鎖による二本鎖DNAへのインベージョンの報告例はわずかであった。
本年度はリボヌクレアーゼA(RNase A)の存在下で単一PNA鎖であっても二本鎖DNAにワトソン・クリック則に基づいて効率的にインベージョンすることを見いだし、その詳細を検討した。電気泳動による各種条件下でのゲルシフトアッセイおよびアニーリング実験の結果より、このような単一PNA鎖のインベージョンは、PNAのインベージョン位置に形成される基質DNAの一本鎖部分へのRNase Aの結合によるインベージョン複合体の安定化、およびRNase A添加による二本鎖DNAの巻き戻しによる不安定化により達成されたと考えられる。このようにPNAの二本鎖DNAへのインベージョンが溶液中に存在するRNase Aによって大幅に促進されることを明らかにした。巨大DNAの特定の配列を正確に認識できる人工核酸PNAのインベージョンの挙動がタンパクの存在によって大きく影響を受けるという結果は、修飾PNAを用いて生体内での部位特異的なゲノム光操作を目指すための重要な知見になると考えられる。

Research Progress Status

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

27年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Thiazole orange-conjugated peptide nucleic acid for fluorescent detection of specific DNA sequences and site-selective photodamage (2014)
  • Author(s): Tanaka, M, et al.
  • Journal Title: RSC advances Volume: 4 Issue: 108 Pages: 63533-63538
  • DOI: 10.1039/c4ra13780a
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] リボヌクレアーゼAによる単一鎖ペプチド核酸の二本鎖DNAへのインベージョン促進 (2016)
  • Author(s): 田仲真紀子、鴫 成実、小宮山 眞
  • Organizer: 日本化学会 第96春季年会
  • Place of Presentation: 同志社大学 京田辺キャンパス（京都府京田辺市）
  • Year and Date: 2016-03-25
• [Presentation] リボヌクレアーゼA添加によるDNAへのペプチド核酸のインベージョン促進 (2015)
  • Author(s): 田仲真紀子、鴫 成実、小宮山 眞
  • Organizer: BMB2015(第３８回 日本分子生物学会年会、第８８回日本生化学大会 合同大会)
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-03
• [Presentation] チアゾールオレンジ修飾ペプチド核酸による二本鎖DNA中での特定配列の蛍光検出と位置選択的光損傷 (2015)
  • Author(s): 田仲真紀子、他
  • Organizer: 第９５回日本化学会春季年会
  • Place of Presentation: 日本大学船橋キャンバス（千葉県船橋市）
  • Year and Date: 2015-03-26