| Project/Area Number |
14021127
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
原 好勇 久留米大学, 医学部, 講師 (40309753)
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| Project Period (FY) |
2002
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2002)
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| Budget Amount *help |
¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2002: ¥3,000,000 (Direct Cost: ¥3,000,000)
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| Keywords | インフルエンザウイルス / RNAポリメラーゼ / PAサブユニット / プロテアーゼ / マトリックスタンパク質 / 相互作用 / 活性阻害 / リバースジェネティクス |
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| Research Abstract |
インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼ・PAサブユニットに存在するプロテアーゼ活性が、ウイルス複製にどのような役割を果たしているか、また新規抗インフルエンザウイルス薬の標的となりえるかについて検討した。本年度はPAのプロテアーゼ活性部位を欠失したノックアウトウイルス「S624A」を作製し、培養細胞系でのウイルス増殖能およびマウスに対する病原性について調べた。
1)S624Aの培養細胞における増殖能について
インフルエンザウイルスWSN株(H1N1)のPAプロテアーゼ活性部位であるセリンをアラニンに置換した変異ウイルス「S624A」を、リバースジェネティクス法により作製した(Brownlee G. G. et al.,Oxford Univ.との共同研究)。これを、MDBK細胞に接種し培養したところ、CPEの進行がWTより少し遅れる傾向を示し、またウイルスの増殖レベルはWTより常に2〜4倍低い値を示した。一方、ウイルス増殖の安定性を調べるため、ウイルスの継代をMDBK細胞で繰り返してみたところ、不完全ウイルス粒子の産生はみられなかった。
2)S624Aの遺伝子の転写・複製能について
インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼの転写活性を定量化するため、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーターとしてNS遺伝子内に挿入し、これをPB1、PB2、PA、NPと同時に発現させ、ルシフェラーゼの発現量により転写活性を測定した。その結果、PAプロテアーゼ活性部位を別のアミノ酸(S624A)に置換しても転写活性に影響は見られなかった。また、mRNA、cRNA、vRNAの合成量についても影響はみられなかった。
3)S624Aのマウスに対する病原性について
S624Aをマウスに経鼻接種し、個体レベルでのS624Aの増殖能および病原性について検討した。その結果、S624Aの病原性はWTと比較して若干低下する傾向がみられた(S624A; LD_<50>=10^<4.6>PFU、WT; LD_<50>=10^<4.0>)。また、マウス肺におけるウイルス増殖能にも若干の低下が見られた。
以上の結果から、PAのプロテアーゼ活性はウイルス増殖に必須ではないが、ウイルス増殖を最大限に引き出すために必要な活性であることが示唆された。
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