Research Project
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
Wgにおいてパルミチン酸が付加されるアミノ酸残基の同定PorcはWgの83-106番アミノ酸から成るドメインに結合する。ショウジョウバエHedgehogのパルミチル化に働くSkinny hedgehogとの類似性、およびwg変異株の存在から、94番目のシステインがパルミチル化されると予想でき、このシステインをグリシンに置換したWg変異体(C94G)を作製した。野性型とC94G変異型WgをS2細胞で発現させ、^<35>S-メチオニシと^3H-パルミチン酸でラベルし、Wgタンパク質への取り込みを測定した。その結果、C94G変異体は^3H-パルミチン酸によってラベルされず、94番目のシスティンがパルミチル化されることが明らかとなった。このシステイン残基はWntファミリーメンバー内で良く保存されているので、この位置におけるパルミチル化の普遍性が推定される。Wntタンパク質の無細胞パルミチル化系の確立生細胞を^3H-パルミチン酸でラベルする方法では、Wntタンパク質への^3Hの取り込み効率が極めて低く、Porcの構造と機能の詳細な解析は困難である。そこで、無細胞パルミチル化系の確立を行なっている。内在性または細胞内で発現させたWntタンパク質は既にパルミチル化されていると考えられるので、mRNAを鋳型にした無細胞翻訳系によりWntタンパク質を合成する。翻訳と同時、または後にミクロソーム画分を添加し、Wntタンパク質への^3H-パルミチン酸の取り込みを測定する。現在までに、イヌ膵臓、マウス脳、肝臓、精巣、およびショウジョウバエ胚由来のミクロソーム画分を用いて実験を行なったが成功していない。パルミチル化され得るWntタンパク質の調製法等について、さらに検討を行なう予定である。
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