RNaseによるRNA分解制御

• Project/Area Number: 14035208
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 正木 春彦 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (50134515)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 尾之内 均 北海道大学, 大学院・農学研究科, 助手 (50322839)
• Project Period (FY): 2002 – 2006
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥40,200,000 (Direct Cost: ¥40,200,000); Fiscal Year 2004: ¥13,400,000 (Direct Cost: ¥13,400,000); Fiscal Year 2003: ¥13,400,000 (Direct Cost: ¥13,400,000); Fiscal Year 2002: ¥13,400,000 (Direct Cost: ¥13,400,000)
• Keywords: コリシン / リボヌクレアーゼ / tRNA / リボソーム / mRNA / メチオニン生合成 / シロイヌナズナ / フィードバック阻害 / アンチコドン

Research Abstract

<代表者>1.コリシンDのtRNase高活性ドメインをC末端103残基(D-CRD595)に特定し、D-CRD595単独およびImmDとの複合体の構造をX線結晶解析で決定し、先にImmDとの複合体構造を決定していたC末端94残基(D-CRD604)と構造と活性を比較した。D-CRD595に比べD-CRD604はN末端9残基を欠き、活性を大きく損なうが、ImmD複合体構造はほとんど同一なので、9残基の特異的重要性が示唆された。ImmDはD-CRD595の活性中心に結合し、またImmDの結合前後でD-CRD595は構造をほとんど変えていなかった。
2.D-CRD595領域のさまざまな点変異体を作製して各残基の寄与を評価した。予想に反しN末端9アミノ酸は個別には重要でなかった。Hisと二つのLysが触媒中心と考えられ、先のコリシンE5とも異なる新しいRNase反応機構が推定できた。
3.D-CRD遺伝子を出芽酵母に導入し、E5-CRDの場合と同様に、CRDの誘導発現に伴ってコロニー形成が停止した。しかし、大腸菌と異なり、tRNA感受性は同等なのに殺菌的でなく静菌的に見え、細胞毒としての作用が細菌と真核細胞とで異なる可能性が生じた。
<分担者>1.植物のメチオニン生合成系の鍵酵素であるシスタチオニンγ-シンターゼ(CGS)の遺伝子発現制御では、S-アデノシルメチオニンに応答して翻訳伸長が停止し、それに引き続いてmRNAの分解が誘導され、その際に5'側を欠いたmRNA分解中間体を生じる。トープリント解析によってリボソームの停止位置を決定したところ、mRNA分解中間体の5'末端の位置は停止したリボソームに覆われる領域の5'側であることが明らかになった。
2.停止したリボソーム内のペプチジルtRNAのtRNA分子種を同定したところ、ペプチジルtRNAがA部位に存在する状態でリボソームが停止していることがわかった。このことから、翻訳の伸長停止はtRNAの転座の段階で起こることが示唆された。このことは翻訳伸長阻害剤を用いた解析からも支持された。

Research Products

• [Journal Article] Aminoacylation of tRNA with D-histidine and D-lysine. (2005)
  • Author(s): Takayama T., Ogawa, T., Hidaka, M., Shimizu, Y., Ueda, T., Masaki, H.
  • Journal Title: Biosci.Biotechnol.Biochem. 69(in press)
• [Journal Article] Relation between tRNase activity and the structure of colicin D according to X-ray crystallography. (2004)
  • Author(s): Yajima, S., Nakanishi, K., Takahashi, K., Ogawa, T., Hidaka, M., et al.
  • Journal Title: Biochem Biophys.Res.Com. 322/3 Pages: 966-973
• [Journal Article] Autoregulation of the gene for cystathionine γ-synthase in Arabidopsis : post-transcriptional regulation induced by S-adenosylmethionine. (2004)
  • Author(s): Onouchi H., Lambein I., Sakurai R., Suzuki A., Chiba Y., Naito S.
  • Journal Title: Biochemical Society Transactions 32/4 Pages: 597-600
• [Publications] Hirao I.: "In vitro selection of RNA aptamers that bind to colicin E3 and structurally resemble the decoding site of 16S ribosomal RNA"Biochemistry. (印刷中). (2004)
• [Publications] Lambein I.: "Decay kinetics of autogenously regulated CGS1 mRNA that codes for cystathionine g-synthase in Arabidopsis thaliana"Plant Cell Physiol. 44・9. 893-900 (2003)
• [Publications] Chiba Y.: "S-adenosyl-L-methionine is an effector in the posttranscriptional autoregulation of the cystathionine gamma-synthase gene in Arabidopsis"Proc.Natl.Acad.Sci.USA.. 100・18. 10225-10230 (2003)
• [Publications] H.MASAKI: "The modes of action of colicins E5 and D, and related cytotoxic tRNases"Biochimie. 84(5/6). 433-438 (2002)
• [Publications] D.B.Goto: "A single-nucleotide mutation in a gene encoding S-adenosylmethionine synthetase is associated with methionine over-accumulation phenotype in Arabidopsis thaliana"Genes Genet. Syst.. 77(2). 89-95 (2002)
• [Publications] K.Ominato: "Identification of a short highly conserved amino acid sequence as the functional region required for posttranscriptional autoregulation of the cystathionine γ-synthase gene in arabidopsis"J. Biol. Chem.. 277(39). 36380-36386 (2002)