| Budget Amount *help |
¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
Fiscal Year 2003: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
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| Research Abstract |
生体内で効果的に機能するアンチセンスオリゴヌクレオチド(AS ODN)をデザインすることを目的として,生体内RNA・DNAハイブリッドの特性や内在性のRNase Hとの関連,およびDNAハイブリッド形成部位について検討した。
(1)生体内RNA・DNAハイブリッドの特性…大腸菌RNase HによるRNA分解は当初精巣特異的であると思われたが,酵素量の増加あるいは反応時間を延長することにより,調べる限りすべての組織のRNAが感受性を示すことが明らかとなった。また,分解産物はノーザンブロット上で複数の明確なハンドとして検出されることや,RNase Hに対する感受性はmRNAにより異なることなどから,DNAはmRNA上の特定部位にハイブリダイズしていることが示唆された。さらに,プライマーを外部から加えなくても逆転写酵素によりcDNA合成が可能であったことから,RNA・DNAハイブリッドの存在がより明確となった。
(2)哺乳動物RNase Hの局在解析…哺乳動物細胞で報告されている2つのRNase Hについて,それぞれに特異的な抗体を作製し解析した結果,RNase H1がおもに核とミトコンドリア画分に存在するのに対し,RNase H2は細胞質に局在していた。RNase H2の細胞質でのRNA・DNAハイブリッド分解への関与を明らかにすることを目的として,遺伝子欠損マウスの作製を試みた。2ラインの変異ES細胞に由来するヘテロ変異マウスが得られ,それぞれのヘテロマウス間での交配を行なったがホモ変異産仔は得られなかった。したがって,胎生致死であることが考えられ,RNase H2がRNA・DNAハイブリッド分解を介して,個体発生あるいは細胞機能の発現に必須な役割を果たしていることが示唆された。
(3)ハイブリッド形成部位の同定…アクチンmRNAについて,reverse ligation-mediated PCRにより切断産物のcDNAを増幅した。それらの末端塩基配列を決定した結果,ハイブリッド形成部位にはある程度の傾向性が存在することが示された。今後は,切断部位の配列情報にもとづいて合成したAS ODNの標的遺伝子に対する発現抑制効果を解析することにより,このアプローチのAS ODNのデザインに対する有効性を検証する予定である。
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