胚性幹細胞を用いた心筋の構築:メダカ心筋分化誘導因子の精製と同定

• Project/Area Number: 14657035
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: General medical chemistry
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 津田 道雄 東海大学, 医学部, 助教授 (00102848)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 兵頭 昌雄 東海大学, 開発工学部, 教授 (60096253)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000); Fiscal Year 2003: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2002: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: 分化誘導因子 / 心筋 / メダカ / 胚細胞 / 心筋細胞 / 心筋特異的転写因子 / 分化誘導因子の精製

Research Abstract

申請者はメダカ胞胚から胚性幹細胞の樹立を試みている途上で、長期継代培養を行っているメダカ細胞株の培養上清を胚細胞に添加したところ、多数の細胞が自律的に収縮する細胞へと分化することを見出し、この上清中に胚細胞から自律的に収縮する細胞を誘導する因子が存在することを発見した。平成14年度では誘導されたのが心筋細胞であることを確認し、同時に少量スケールでの部分精製まで成功していたが、平成15年度の研究はアミノ酸配列の決定やクローニングのために本因子を大量にかつ高度に精製することであった。
「分化誘導因子の精製」
分化誘導因子の精製材料は、メダカ胚より樹立した、心筋分化誘導因子を分泌している長期培養細胞株の培養上清を用い、硫安分画法、1st SP-Sepharose columnイオン交換カラム、Sephadex-G75ゲルろ過カラム、ヒドロキシアパタイトカラム、2nd SP-Sepharose columnを用いてほぼ単一まで精製することに成功した。
10Lの長期培養細胞株の培養上清から約3万倍の精製度で約20μgの収量であった。
現在さらに逆相カラムクロマトグラフィーで単一性を確認しプロテアーゼ処理後のペプチドマッピングを行っている。この結果を用いてクローニングに進め、本因子の同定を行う予定である。