アデノ随伴ウイルスを用いた血友病インヒビター患者に対する遺伝子治療用ベクターの開発

• Project/Area Number: 14657249
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Hematology
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 鈴木 隆史 東京医科大学, 医学部, 助手 (80287143)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2003: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2002: ¥2,700,000 (Direct Cost: ¥2,700,000)
• Keywords: 血友病 / インヒビター / アデノ随伴ウイルス / 遺伝子治療

Research Abstract

血友病AあるいはBインヒビターの治療に用いられるリコンビナント活性型第VII因子製剤(rFVIIa)は半減期が短いことから、その一定レベルの持続的な発現がインヒビター患者の出血予防となる可能性があり、FVIIaとして細胞外へ分泌されるメカニズムを持たせた治療用ベクターのデザインに着手した。平成14年度に、遺伝子工学的操作にてヒトFVIIcDNAをAAVベースのプラスミドに組み込み、さらに、FVIIが細胞外分泌時にFVIIaとなるべく、FXがfurin/PACEによりRKRというアミノ酸配列を認識しこの部位に作用し成熟FXとなる。このことを受け、RKRをコードする9塩基をFVII重鎖-軽鎖間に挿入しベクタープラスミドを作成した。平成15年度には、本ベクタープラスミドのRKR配列をダイレクトシークエンスにて確認するとともに、発現実験に先立ち、2種類の市販の抗FVIIポリクローナル抗体を準備し、抗原量測定のためのELISAを構築した。FVIIcDNAおよびFVIIcDNAにRKR配列を組み込んだ各々2つのベクタープラスミドを大量培養純化した。HEK293細胞を6穴プレートに準備し、2μg/wellのプラスミドDNAをリポフェクション法によりトランスフェクションした。数回のトランスフェクションを試みたが、培養72時間後においても有意なFVIIタンパクの発現は得られなかった。このことは、9塩基挿入が細胞外分泌の抑制を引き起こしたことが推測された。ELISAやトランスフェクションの方法にも改良の余地があると思われ、本研究期間内において提示できる結果は得られなかったが、期間終了後も上記を考慮しつつ課題に取り組む予定である。