| Project/Area Number |
14657250
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Hematology
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| Research Institution | Research Institute, International Medical Center of Japan |
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Principal Investigator |
湯尾 明 国立国際医療センター, 研究所, 部長 (90221663)
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| Project Period (FY) |
2002 – 2003
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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| Budget Amount *help |
¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,300,000)
Fiscal Year 2002: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
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| Keywords | 7回膜貫通型受容体 / EMR1 / 単球 / G蛋白共役受容体 / モノクローナル抗体 |
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| Research Abstract |
細胞外EGF様反復構造を有する7回膜貫通型ヒト受容体EMR1は、一般的な化学性走化因子の受容体とは異なる特異な構造を有する。本研究においては、この受容体に対するモノクローナル抗体を作成し、ヒト血球における発現分布を明らかにする。また、リガンド分子もしくは抗受容体抗体を用いて、会合分子の存在やシグナル伝達機構を探求する事を目指した。
昨年より継続して可溶性組換えヒトEMR1分子の構築及び発現を検討してきた。これは免疫原として使用する為、及び直接細胞へ作用させて細胞膜表面上のリガンド分子の解析に用いる為の二点の理由からである。ヒト免疫グロブリン遺伝子と融合させた発現カセットを構築するにあたり、近年その存在が知られる様になったGPSドメインが未知の蛋白分解酵素の攻撃を受け、その結果生成した融合蛋白質が分解される事が判明した為、その部位を除去した可溶性組換えヒトEMR1発現カセットを構築し、アフリカミドリザル由来のCOS1及びCOS7細胞へ導入したが、遺伝子が導入され蛋白質を発現している細胞は容易に速やかな細胞死を起こし、一過性発現で組み替え蛋白質を十分量得ることは困難であった。そこでCOS細胞以外での蛋白産生系を検討し、可溶性蛋白質産生に適した細胞としてハムスター由来のCHO細胞及びBalb/cマウス由来のBalb/3T3細胞を選択した。Balb/3T3細胞については、SV40ウイルス断片を含む当該発現ベクターとの組み合わせを考慮して予めSV40ゲノムにて形質転換させ、SV40LargeT抗原を高発現する細胞をも樹立した。この細胞へ導入したSV40複製起点を含むプラスミドはCOS細胞と同等以上の複製効率を示した。これらの細胞を用い、更に蛋白質発現ベクターとしてヒトEF-1alphaプロモーターを用いた発現系を併せて使用することで融合蛋白質の産生性を改善する事が出来た。
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