遺伝学・染色体工学的手法を用いた高等脊椎動物のセントロメア形成機構の解明

• Project/Area Number: 14704002
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 遺伝
• Research Institution: National Institute of Genetics (2003-2004); The Graduate University for Advanced Studies (2002)
• Principal Investigator: 深川 竜郎 国立遺伝学研究所, 分子遺伝研究系, 助教授 (60321600)
• Project Period (FY): 2002 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥29,510,000 (Direct Cost: ¥22,700,000、Indirect Cost: ¥6,810,000); Fiscal Year 2004: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000); Fiscal Year 2003: ¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000); Fiscal Year 2002: ¥15,210,000 (Direct Cost: ¥11,700,000、Indirect Cost: ¥3,510,000)
• Keywords: セントロメア / DT40細胞 / CENP-A / CENP-H / CENP-I / 染色体分配 / キネトコア / RNAiマシーナリー / Nuf2 / Dicer / ZW10 / チェックポイント

Research Abstract

生物が生命を維持するためには、ゲノム情報を包括する構造体である染色体が安定に保持・増殖されなければならない。正常な細胞では、ほぼ決まった時間周期でゲノムの複製と分配が正確に行われる。染色体複製・分配のような基本的な生体反応に狂いが生じると染色体の異数化、がん化など細胞に対する悪影響が生じる。したがって、染色体複製や分配の正確な分子機構を解明することは、遺伝学における本質的な課題の一つである。我々は、染色体分配に重要な働きを担うセントロメアの機能解析を行っている。本研究では、哺乳類細胞の数十から数百倍の頻度で相同組換えが起こるニワトリDT40細胞を用いた各種セントロメアタンパク質のノックアウト解析法を通じて、高等脊椎動物のセントロメアの形成に関する分子機構の理解を目指している。本年度は、CENP-Aノックアウト株の詳細な表現型解析と、新規セントロメアタンパク質の同定および機能解析を中心に研究を進めた。さらに、RNAiマシーナリーとセントロメア構築との関連解明に向けた研究も行った。1)CENP-Aのノックアウト細胞の解析の結果、Mad2およびBubR1というチェックポイントタンパク質の局在異常が観察できた。CENP-Aのノックアウト株では、最初に紡錘体チェックポイント機構の活性化が起きて、細胞周期がM期で遅延した後、分裂後期に入って行くことから、CENP-Aはチェックポイントの「活性化」より「維持」に影響を与えると結論した。2)新規セントロメアタンパク質の同定を目指して、CENP-HとCENP-Iを含む巨大複合体を精製した。質量分析によるアミノ酸配列の決定に引き続きcDNAクローニングを行い、複合体に含まれる5種類のタンパク質を同定した。いずれも、細胞周期を通じてセントロメアへ局在していた。それらのノックアウト細胞の樹立に成功した。3)RNAiマシーナリーに関与するDicer遺伝子の条件的ノックアウト細胞を解析した結果、Dicerはヘテロクロマチン構築と姉妹染色分体の結合に重要な働きを担っていると結論した。

Research Products

• [Journal Article] Functional region of CENP-H interacts with Nuf2 complex, which functions as a connector between the inner and outer kinetochores. (2005)
  • Author(s): Yoshikazu Mikami
  • Journal Title: Molecular and Cellular Biology 25 Pages: 1958-1970
• [Journal Article] Efficient large-scale protein production of larvae and pupae of silkworm by Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus bacmid system. (2005)
  • Author(s): Tomoko Motohashi
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications 326 Pages: 564-569
• [Journal Article] Dicer is essential for formetion of the heterochromatin structure in vertebrate cells. (2004)
  • Author(s): Tatsuo Fukagawa
  • Journal Title: Nature Cell Biology 6 Pages: 784-791
• [Journal Article] Centromere DNA, proteins and kinetochore assembly in vertebrate cells. (2004)
  • Author(s): Tatsuo Fukagawa
  • Journal Title: Chromosome Research 12 Pages: 557-567
• [Journal Article] Assembly of kinetochores in vertebrate cells. (2004)
  • Author(s): Tatsuo Fukagawa
  • Journal Title: Experimental Cell Research 296 Pages: 21-27
• [Journal Article] 染色体構造と機能に関わるエピジェネティクス (2004)
  • Author(s): 深川竜郎
  • Journal Title: わかる実験医学シリーズ「注目のエピジェネティクスがわかる」 Pages: 80-87
• [Journal Article] 高等脊椎動物のセントロメア構築と機能発現 (2004)
  • Author(s): 深川竜郎
  • Journal Title: 医学のあゆみ 208 Pages: 793-798
• [Book] 「細胞核のダイナミクス」:高等脊椎動物のセントロメアタンパク質の集合と機能発現 (2004)
  • Author(s): 深川竜郎
  • Total Pages: 9
• [Publications] Tetsuya Hori: "Dynamic behavior of Nuf2-Hec1 complex that localizes to the centrosome and centromere and is essential for mitotic progression in vertebrate cells"Journal of Cell Science. 116. 3347-3362 (2003)
• [Publications] Vinciane Regnie: "Characterization of chicken CENP-A and comparative sequence analysis of vertebrate centromere-specific histone H3-like proteins"Gene. 316. 39-46 (2003)
• [Publications] Tatsuo Fukagawa: "Assembly of kinetochores in vertbrate cells"Experimental Cell Research. in press. (2004)
• [Publications] 深川竜郎: "セントロメア特異的なクロマチン構造"生体の科学. 54. 179-184 (2003)
• [Publications] 深川竜郎: "染色体分配に必須な構造:動原体"細胞工学. 22. 267-271 (2003)
• [Publications] 深川竜郎: "動物細胞のM期での動態の可視化"遺伝子医学. 7. 96-100 (2003)
• [Publications] Ai Nishihashi: "CENP-I is essential for centromere function in vertebrate cells"Developmental Cell. Vol.2. 463-476 (2002)
• [Publications] Jenny M. Spence: "Co-localisation of Centromere Activity, CEN Proteins and a Topoisomerase II Cleavage Site to a fixed region of limited extent within the Human X α-satellite Locus DXZ1"The EMBO Journal. Vol.21. 5269-5280 (2002)
• [Publications] Tomoko Hayashi: "Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells"Experimental Cell Research. Vol.280. 212-221 (2002)
• [Publications] Mizuki Ohno: "Triplex-forming DNAs in the human interphase nucleus visualized in situ by polypurine/polypyrimidine DNA probes and antitriplex antibodies"Chromosoma. Vol.111. 201-213 (2002)
• [Publications] 深川竜郎: "染色体と細胞骨格の接点:キネトコア"細胞工学. 22巻・3月号. 267-271 (2003)
• [Publications] 深川竜郎: "動物細胞のM期での動態の可視化"遺伝子医学. (印刷中). (2003)
• [Publications] Eiichiro Sonoda: "International Congress Series 1246 "Generation and Phenotype Analysis of Conditionally Inactivated Mutant cells""Elsevia Science. 19 (2002)