| Project/Area Number |
14750633
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
生物・生体工学
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
STEFANO R FERRI (FERRI Stefano R) 東京農工大学, 工学部, 助手 (90334474)
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| Project Period (FY) |
2002 – 2003
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
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| Budget Amount *help |
¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000)
Fiscal Year 2003: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2002: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
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| Keywords | 蛋白質-蛋白質相互作用 / バイオセンサー / 生物発光 / lux遺伝子 / Photobacterium phosphoreum / protein-protein interaction / bioluminescence / biosensor / lux |
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| Research Abstract |
本研究は、タンパク質-タンパク質相互作用検出用センサーシステムを開発することを目的とする。アシルCoAプロテインシンテターゼ(S)とアシルCoAレダクターゼ(R)は、脂肪酸還元酵素複合を構成しており、SからRへ活性化された長鎖脂肪酸が運搬されるとルシフェラーゼの反応に必要な基質である長鎖アルデヒドが生成される。従ってRとSサブユニットを、それぞれ相互作用を調べたい2つタンパク質と一つずつ融合させ、相互作用すると長鎖アルデヒドが生成し、ルシフェラーゼ反応により発光する。この発光を検出することによってタンパク質-タンパク質相互作用検出システムが構築できる。本センサーシステムは、更に、それらの相互作用を活性化させたり阻害したりする新しいリガンドの探索に有用であるばかりでなく、新しい標的蛋白質の有用なスクリーニング系としても利用可能である。
発光細菌であるPhotobacterium phosphoreumからluxC(S)とluxE(R)をクローニングし、大量発現用のpETベクターに挿入して大腸菌で発現させた。その抽出液は活性を示し、活性のある形で2つの遺伝子を発現させることに成功した。また、その遺伝子の5'端、3'端のどちらにHis-tagを添加しても活性は得られ、各サブユニットに相互作用を観察したい蛋白質を融合させることが可能であることが確認できた。
元々相互作用を観察するモデルと考えていたDnaAタンパク質は宿主のE.coliに対して毒性が高く発現が上手くいかないことが判明したので、ロイシンジッパー蛋白質であるC-JunとFosBをモデル蛋白質として選び、その発現を試みている。この2つの蛋白質は強い結合を示すはずであり発現がうまくいけば、luxC(S)とluxE(R)は近接した状態となり、調査アルデヒドが生成するはずなので発光が観察できると予想される。
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