生体関連試料の試薬無供給式測定システムの開発

• Project/Area Number: 14750642
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 生物・生体工学
• Research Institution: Seikei University
• Principal Investigator: 青柳 里果 成蹊大学, 工学部, 助手 (20339683)
• Project Period (FY): 2002 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2004: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2003: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2002: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
• Keywords: 免疫測定法 / 蛍光発光 / 非分離免疫測定法 / タンパク質 / 抗原抗体反応 / プロテインA / 免疫グロブリンG / 量子ドット / FITC

Research Abstract

その場測定を可能とするために、非分離免疫測定法の固定化蛍光標識試薬を用いた系(不均一系)で実用化を目指し、モデル試料として免疫グロブリンG(IgG)を選び、ガラスへ固定化した蛍光標識プロテインAを用いて、蛍光増強法でIgGの定量を試みた。はじめは、蛍光光度計セル内にガラス表面に固定化したフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識プロテインA固相化試薬を設置することにより、IgG溶液を測定した。その結果、IgG濃度に応答してFITC標識プロテインA固相化試薬の蛍光強度は増強した。一方、プロテインAと結合性のないHSA溶液と反応させ、同様に蛍光強度と濃度の関係を調べた結果では、HSA濃度が変化しても蛍光強度はほとんど変化しなかったので、プロテインAと結合したIgGへの蛍光応答特異性が確認できた。さらに、各濃度のIgG溶液を測定した結果から、IgG濃度が大きいほど、蛍光増強も速く、大きくなることが示された。そこで、初めの5分間の蛍光強度の経時変化から、蛍光強度経時変化の初速度を求め、IgG濃度との相関を検討した結果、IgG濃度10〜50μg/mlの範囲で有効な相関が得られた。したがって、蛍光増強法を利用した測定で、非定常測定によって、数分以内の迅速測定が可能であることが示された。さらに、センサの表面状態を飛行時間型二次イオン質量分析法で評価し、固定化したタンパク質試薬と試料溶液中のタンパク質との反応について調べ、最適固定化条件を検討した。
最終的に、光ファイバーへこの測定システムを応用するためには、FITCでは十分な蛍光強度が得られなかったため、量子ドットを蛍光標識剤として用いた。その結果、高感度測定を実現し、光ファイバー先端に蛍光標識プロテインAを固定化し、in situでモデル試料IgG溶液を測定できるシステムの構築に成功した。

Research Products

• [Journal Article] Development of fluorescence change-based, reagent-less optic immunosensor (2005)
  • Author(s): S.Aoyagi, M.Kudo
  • Journal Title: Biosensors & Bioelectronics 20(8) Pages: 1680-1684
• [Journal Article] Effective monitoring of protein reaction on glass plate surfaces by TOF-SIMS (2005)
  • Author(s): S.Aoyagi, M.Kudo
  • Journal Title: Biosensors & Bioelectronics 20(8) Pages: 1626-1630
• [Journal Article] Observation of fluorescence labeled protein A on biosensor surface by means of TOF-SIMS (2005)
  • Author(s): S.Aoyagi, M.Kudo
  • Journal Title: Sensors & Actuators B : Chemical (印刷中)
• [Journal Article] Estimation of protein immobilization on biosensor by TOF-SIMS (2004)
  • Author(s): S.Aoyagi, Y.Oiwa, M.Kudo
  • Journal Title: Applied Surface Science 231-232 Pages: 432-436
• [Journal Article] Reagentless and regenerable immunosensor for monitoring of immunoglobulin G based on non-separation immunoassay (2003)
  • Author(s): S.Aoyagi, R.Imai, K.Sakai, M.Kudo
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics 18 Pages: 791-795
• [Journal Article] TOF-SIMSによる金属、ガラス、高分子上のタンパク質測定 (2003)
  • Author(s): 青柳里果, 工藤正博
  • Journal Title: 日本学術振興会 マイクロビームアナリシス第141委員会 第112回 研究会資料 Pages: 1319-1319
• [Journal Article] タンパク質のin situ測定に適した蛍光免疫センサの開発 (2002)
  • Author(s): 青柳里果, 大岩佑子, 工藤正博
  • Journal Title: Chemical Sensors 18(Suppl.B) Pages: 61-63
  • NAID: 80015929334
• [Book] Encyclopedia of Sensors(Edited by C.A.Grimes)執筆部分Protein monitoring on biomaterial surface : Application of TOF-SIMS (2005)
  • Author(s): S.Aoyagi, M.Kudo
  • Publisher: American Scientific Publishers, CA, USA(印刷中)
• [Publications] 青柳里果, 大岩佑子, 工藤正博: "タンパク質のin situ測定に適した蛍光免疫センサの開発"Chemical Sensors. 18 Supplement B. 61-63 (2002)
• [Publications] S.Aoyagi, R.Imai, K.Sakai, M.Kudo: "Reagentless and regenerable immunosensor for monitoring of immunoglobulin G based on non-separation immunoassay"Biosensors and Bioelectronics. 18. 791-795 (2003)
• [Publications] 青柳里果, 工藤正博: "TOF-SIMSによる金属、ガラス、高分子上のタンパク質測定"日本学術振興会 マイクロビームアナリシス第141委員会. 第112回研究会資料. No.1319 (2003)
• [Publications] 青柳里果, 大岩佑子, 工藤正博: "タンパク質のin situ測定に適した蛍光免疫センサの開発"Chemical Sensors. 18 Supplement B. 61-63 (2002)