プロテインメモリー現象によるタンパク質の構造変化と保持機構の解明

• Project/Area Number: 14760064
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: 応用微生物学・応用生物化学
• Research Institution: National Food Research Institute
• Principal Investigator: 韮澤 悟 独立行政法人食品総合研究所, 生物機能開発部, 主任研究官 (10343823)
• Project Period (FY): 2002 – 2004
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2004)
• Budget Amount: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2004: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000); Fiscal Year 2003: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2002: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 分子内シャペロン / アミノペプチターゼ / X線結晶構造解析 / キメラ酵素 / プロ酵素 / アミノ酸変異体 / アミノペプチダーゼ / アミノ酸部位特異的変異

Research Abstract

本課題では、金属エキソペプチダーゼであるアエロモナスアミノペプチダーゼにおいてプロテインメモリー現象を引き起こす分子内シャペロンの特性を解析するとともに、分子内シャペロンの変異によって生じる成熟体部分の立体構造の変化を原子レベルで解明することが目的である。本年度は下記1、2の研究結果が得られた。
1、アエロモナスアミノペプチダーゼと同じファミリーに属し、約60%のアミノ酸配列の相同性を持つビブリオアミノペプチダーゼを用いて分子内シャペロン部位を交換したキメラ酵素を対象に、X線結晶構造解析および立体構造モデルの構築、精密化を行った。その結果、キメラアミノペプチダーゼプロ体について、R=20.1%の構造モデルを得た。金属エキソペプチダーゼにおいて、分子内シャペロン部位の立体構造を明らかにしたのは、これが初めてである。さらに、構造モデルの解析の結果、分子内シャペロン部位はCys77を介して金属原子と相互作用していること、分子内シャペロンのプロセシング部位が分子表面に存在していること、分子内シャペロン部位の疎水性アミノ酸が疎水コアを形成していることが推定できた。
2、分子内シャペロン部位の各種アミノ酸変異体を取得した結果、Trp24、Ile25、His71、Glu72、Cys77の各アミノ酸残基が酵素全体のフォールディングに重要な役割を担っていることが明らかになった。

Research Products

• [Journal Article] Characterization and kinetic analysis of enzyme-substrate recognition by three recombinant lactococcal tripeptidases (2005)
  • Author(s): S.Mori, S.Nirasawa, S.komba, T.Kasumi
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta 1748 Pages: 26-34
• [Journal Article] Chitobiose phosphorylase from Vibrio proteolyticus, a member of glycosyl transferase family 36,has an (alpha/alpha)6 barrel fold like clan GH-L (2004)
  • Author(s): M.Hidaka, Y.Honda, M.Kitaoka, S.Nirasawa, K.Hayashi, T.Wakagi, H.Shoun, S.Fushinobu
  • Journal Title: Structure 12・6 Pages: 937-947
• [Journal Article] Recombinant curculin heterodimer exhibits taste-modifying and sweet-tasting activities (2004)
  • Author(s): M.Suzuki, E.Kurimoto, S.Nirasawa, Y.Masuda, K.Hori, Y.Kurihara, N.Shimba, M.Kawai, E.Suzuki, K.Kato
  • Journal Title: FEBS Letters 573 Pages: 135-138
• [Journal Article] Splitting monomeric enzyme of family 3 b-glucosidase into two molecules while recovering the catalytic activity (2004)
  • Author(s): K.Hayashi, B.J.Kim, M.Selanere, S.Nirasawa, M.Kitaoka
  • Journal Title: Biotechnology of Ligunocellulose Degradation and Biomass Utilization Pages: 728-735
• [Publications] Nirasawa, S., Hayashi, K.: "Construction and characterization of a chimeric aminopeptidase"Protein science. 12. 148 (2003)
• [Publications] Nishimoto, M., Fushinobu, S., Miyanaga, A., Wakagi, T., H.Shoun, H., Sakka, K., Ohmiya, K., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Hayashi, K.: "Crystallization and preliminary X-ray analysis of xylanase B from Clostridium stercorarium"Acta Crystallographica Section D. 60・2. 342-343 (2004)
• [Publications] Nirasawa, S., Hayashi, K.: "[M647] Pro-aminopeptidase processing protease : In The Handbook of Proteolytic Enzymes, 2nd edn."Barrett, A., Rawlings, N., Woessner, F.. 2 (2004)
• [Publications] Nirasawa, S., Hayashi, K.: "Role of the N-terminal propeptide of bacterial zinc aminopeptidase in folding and stability"Protein science. 12. 78 (2003)
• [Publications] Tang, B., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Marie-Claire, C., Hayashi, K.: "General function N-terminal propeptide on assisting Protein folding and inhibiting catalytic activity based on observations with a chimeric thermolysin-like protease"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 301・4. 1093-1098 (2003)
• [Publications] Tang, B., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Ma, Hayashi, K.: "The role of the N-terminal propeptide of the pro-aminopeptidase processing Protease : refolding, processing, and enzyme inhibition"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 296・1. 78-84 (2002)
• [Publications] Tang, B., Nirasawa, S., Kitaoka, M., Ma, Hayashi, K.: "In vitro stepwise autoprocessing of the proform of proaminopeptidase processing Protease from Aeromonas caviae T-64"Biochim.Biophys. Acta. 1596・1. 16-27 (2002)
• [Publications] Majibuf, R.M., Bhuiyan, S.H, Nirasawa, S., Kitaoka, M., Ma, Hayashi, K.: "Characterization of an endo-beta-1, 4-glucanase of Thermotoga maritima expressed in Escherichia coli"Journal of Applied Glycoscience. 49・4. 487-495 (2002)