| Project/Area Number |
14770093
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
|
| Allocation Type | Single-year Grants |
|---|
| Research Field |
Experimental pathology
|
|---|
| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
|---|
Principal Investigator |
土田 孝 浜松医科大学, 医学部, 助手 (30317755)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2002 – 2003
|
| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2003)
|
| Budget Amount *help |
¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,600,000)
Fiscal Year 2003: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
Fiscal Year 2002: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
|
|---|
| Keywords | リボザイム / マウスサイトメガロウイルス / 前初期(IE)遺伝子 / 増殖抑制 / 潜伏感染 / 分化誘導 |
|---|
| Research Abstract |
マウスサイトメガロウイルス(MCMV)前初期(IE)遺伝子を標的としたリボザイムの作成
マウスCMV(MCMV)のIE遺伝子のうちIE1とIE3に共通なmRNAに対するハンマーヘッド型リボザイムを数種類設計し、in vitro cleavageにて切断活性を確認した。
MCMV IE mRNAを標的としたリボザイムの培養細胞への導入と発現
in vitro cleavageの結果より、切断活性の高いリボザイムをtRNAプロモーターとpuromycin耐性遺伝子もつplasmidベクターに挿入した。このリボザイム発現ベクターをNIH3T3細胞にトランスフェクションし、puromycin耐性クローンを作製し、リボザイム高発現クローンをRT-PCRで確認した。
リボザイム発現細胞におけるMCMV IE遺伝子産物の発現抑制と感染抑制の確認
リボザイム高発現細胞および対照NIH3T3にMCMVを感染させた。MCMV IE遺伝子産物の発現をIE1特異抗体(N2)、を用いたフローサイトメトリーで経時的な解析を施行したところ、リボザイム高発現細胞では対照NIH3T3と比較して10倍程度のIE発現抑制効果を確認した。また、培養上清および細胞ホモジネートとマウス胎児線維芽細胞を用いたプラークアッセイによってもウイルス増殖抑制効果が確認された。
MCMV潜伏感染モデルにおけるウイルス増殖抑制の試み
F9細胞(teratocarcinoma cell line)にリボザイム発現ベクターを導入しリボザイム発現クローンを作成した。GFP発現MCMV感染後72時間のリボザイム発現クローンと対照F9をレチノイン酸により分化誘導したところ2週間後のGFP発現に著明な差がみられた。増殖抑制効果は、プラークアッセイとN2を用いたフローサイトメトリーによっても確認された。
|
