リコンビナントBad蛋白のグリオーマ細胞内導入によるアポトーシス誘導

• Project/Area Number: 14770716
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Cerebral neurosurgery
• Research Institution: 佐賀医科大学
• Principal Investigator: 一ノ瀬 誠 佐賀医大, 医学部, 助手 (60336138)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000); Fiscal Year 2003: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2002: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
• Keywords: 変異Bad-DTTR / アポトーシス / グリオーマ

Research Abstract

Bad蛋白は、アポトーシス抑制蛋白であるBcl-xLと細胞内でinteractionすることによりアポトーシスを誘導し、リン酸化によって不活化されることが知られている。今回、マウスBad遺伝子をテンプレートに、2箇所のリン酸化部位、つまり、コドン112および136のセリンをアラニンに置換するようにPCR法を用いたmutagenesisを行い、変異Badを作成した。この変異Bad遺伝子と、ジフテリアトキシンのトランスポートドメイン(DTTR)とのgenetic fusionを行い、大腸菌を用いた蛋白発現系にて融合蛋白Bad-DTTRを精製した。この精製融合蛋白Bad-DTTRをグリオーマ細胞の培養液中に加えると、濃度依存性に殺細胞効果およびアポトーシス誘導能を観察することができた。そのIC50は変異Bad-DTTR蛋白で、5×10^<-8>Mであった。Bad蛋白のみでは殺細胞効果を示さないこと、またこの融合蛋白は細胞内のBcl-xLの分布を変化させたことから、この融合蛋白が細胞内に取り込まれ、Bcl-xLとのinteractionにより、アポトーシスを誘導していることが考えられた。また、長期的な細胞増殖抑制効果を見るために、clonogenic assayを行い、この変異Bad-DTTR蛋白は自然体Bad-DTTR蛋白に比較して強い増殖抑制効果を示した。さらにコドン155を含む3箇所のリン酸化部位を変異させたBad-DTTRは、2箇所の変異のものと殺細胞効果に違いは見られず、コドン112および136のリン酸化部位が不活化には重要であると考えられた。

Research Products

• [Publications] Makoto Ichinose, et al.: "Extracellular Bad fused to toxin transport domain induces apoptosis"Cancer Research. 62. 1433-1438 (2002)