遺伝子欠損マウスを用いた光障害による網膜視細胞死の分子解析

• Project/Area Number: 14770948
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Ophthalmology
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 新井 純 信州大学, 医学部附属病院, 助手 (70334894)
• Project Period (FY): 2002 – 2003
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2003)
• Budget Amount: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2003: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000); Fiscal Year 2002: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000)
• Keywords: 網膜光障害 / 網膜視細胞 / アポトーシス / caspase-1 / caspase-3 / 遺伝子欠損マウス

Research Abstract

1.caspase-1ノックアウトマウスとその野生型マウス(C57BL/6)の右眼を散瞳した後に、白色蛍光灯を20000ルクス、2時間照射した。
2.光照射後12,24,48,168時間のそれぞれでマウス眼球摘出・固定し、その網膜のパラフィン切片、凍結切片を作成した。
3.作成した標本において、TUNEL法(Gavrieli et al.J.C.B.1992)による染色を加え、網膜視細胞層でアポトーシスを起こしている細胞を検出した。野生型マウスでは24時間後をピークとして網膜視細胞層にTUNEL陽性細胞が見られた。168時間後にはほとんどTUNEL陽性細胞は認められなかった。各時間経過において、caspase-1ノックアウトマウスではTUNEL陽性細胞数は野生型と比較して有意に減少していた。
4.網膜凍結切片を用いて免疫組織化学的検討を行った。野生型マウスの網膜視細胞層においてcaspase-1抗体、caspase-3陽性細胞数は光照射24時間後に照射前よりも増加していた。
5.経時的に摘出した網膜からタンパクを抽出し、網膜光障害におけるcaspaseファミリーの酵素活性を合成ペプチド基質を用いて測定した(Thomberry et al.J.Biol.Chem.1997)。光照射24時間後の野生型マウス網膜のcaspase-1様酵素活性は照射前より上昇していた。48時間後には照射前と同程度に低下した。
以上の結果からマウス網膜光障害による網膜視細胞のアポトーシスにcaspase-1が大きく関与していることが示唆された。